应用胆管正常上皮细胞、肝内胆管癌及肝门部胆管癌细胞株,经qRT-PCR和Western blot检测各细胞株中FBXW7 mRNA和蛋白表达水平。2.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除胆管癌及对应癌旁新鲜组织,经Western blot检测胆管癌及癌旁组织中FBXW7蛋白表达水平。3.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。4.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。5.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除远端胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。[结果]1.

BMS-754807订单 qRT-PCR和Western blot结果显示正常胆管上皮细胞(HIBEpic)中FBXW7 mRNA和蛋白水平明显高于肝内胆管癌细胞(HuCCT1和RBE)及肝门部胆管癌细胞(QBC939和FRH0201)。2.收集7例胆管癌及对应癌旁新鲜组织,Western blot结果显示其中6例胆管癌癌旁组织中FBXW7表达明显高于胆管癌组织。3.通过免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝内胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝内胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期明显相关。4.通过免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝门部胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝门部胆管癌转移、分化程度及TNM分期明显相关。5.通过免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明各组间FBXW7表达无明显差异；统计学分析显示FBXW7表达与远端胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期无明显相关性。[结论]1.FBXW7在胆管正常上皮细胞中表达量明显高于肝内胆管癌细胞及肝门部胆管癌细胞,且FBXW7在胆管癌癌旁组织中表达明显高于胆管癌组织,提示FBXW7在胆管癌中为抑癌基因。2.

为什么 FBXW7可抑制肝内胆管癌及肝门部胆管转移,且与肿瘤分化程度及TNM分期明显相关。第二部分FBXW7调控胆管癌上皮-间质转化、干细胞特性及转移的作用研究[目的]上述临床研究结果表明FBXW7可抑制胆管癌转移,且与肝内胆管癌及肝门部胆管癌分化程度及TNM分期明显相关。本部分通过体外细胞实验和体内裸鼠转移模瘤型进一步检测FBXW7在胆管癌EMT、干细胞特性和转移中的作用。[方法]1.构建FBXW7干扰质粒(pBabe-shFBXW7.1及pBabe-shFBXW7.2),经逆转录病毒转染pBabe-shFBXW7.1、pBabe-shFBXW7.2及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较高的HuCCT1细胞和RBE细胞构建FBXW7稳定低表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western

blot检测所构建的稳定转染细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。2.构建FBXW7高表达质粒(pBabe-FBXW7),经逆转录病毒转染pBabe-FBXW7及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较低的QBC939细胞和FRH0201细胞构建FBXW7稳定过表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western NLG919 价格 blot检测所构建的稳定转染的细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。3.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,普通光学显微镜观察FBXW7表达改变对细胞表型的影响；经Western blot检测EMT相关标志分子(E-cadherin、 α-catenin、Fibronectin及Vimentin)的表达水平改变,验证FBXW7对胆管癌EMT的调控作用。4.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过Western blot检测其干细胞特性标志分子(Nanog、OCT4)的表达；经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验检测干细胞自我更新能力,验证FBXW7对胆管癌干细胞特性的调控作用。5.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室细胞迁移实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞迁移能力中的作用；经Matrigel侵袭实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞侵袭能力中的作用。6.