4、5、6mg/L) Hoechst33342孵育1×106个/mlSKOV3细胞90min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例；选取不同细胞密度的(6×105,7×105,8×105,9×105,1×106个/ml) SKOV3细胞悬液,3mg/L的Hoechst33342孵育90min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例。 结果：通过Hoechst33342蓝光和红光双参数图,SP细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域。Hoechst33342浓度不变时,SP细胞比例随细胞密度的增加而升高；SKOV3细胞密度不变时,SP细胞比例及细胞活性随hoechst33342浓度升高而降低。卵巢癌SKOV3细胞株在细胞密度为8×105个/m1,加入终浓度为3mg/L的Hoechst33342,37℃水浴90min,为最佳染色条件,此时SP细胞比例为(1.12±0.104)%,且细胞保持良好的活性。 结论：建立了分选人卵巢癌细胞株SKOV3中存在SP细胞的最佳实验条件,为分选其他肿瘤组织或细胞株中的SP细胞建立了参照标准。

第三章卵巢癌SKOV3细胞中SP细胞中卵巢癌干细胞相关表面标志物表达 目的：检测卵巢癌SKOV3细胞系中SP和NSP细胞中卵巢癌干细胞相关标志物和基因表达差异。 方法：荧光染料Hoechst33342和荧光标记抗体共染染SKOV3细胞,流式细胞仪检测SP和NSP细胞中ALDH2, Idelalisib CD90, CD133, CD117, ABCG2, CD44表达；荧光定量PCR检测SP和NSP细胞中NANOG, ALDH2,, CD133, ABCG2, SOX2, CD117基因在表达差异。 结果：流式细胞仪检测SP和NSP细胞中CD90、CD133、CD117、CD44阳性表达差异无统计学意义。SP和NSP细胞中ALDH2和ABCG2的阳性表达分别为87.3±5.76%、29.48±4.43%、5.32±0.47%、3.01±1.69%,差异有统计学意义P<0.05)。接种SP和NSP细胞数目为800,400,200个时,集落形成率分别为8.9±1.1%、10±2.3%、12±1.5%和1.7±0.2%、1.75±0.5%、3.0±0.8%,相同接种细胞密度下SP细胞的集落形成能力大于NSP细胞(P<0.05)。SP细胞较NSP细胞有更强的侵袭和迁移能力,其中侵袭细胞数目分别为60±5和34±4,迁移细胞数目分别为91±6和74±4,差异有统计学意义(P<0.05。荧光定量PCR结果显示,BCL-2基因在SP细胞中表达较NSP和SKOV3低,差异有统计学意义。ABCB1基因在SP细胞中相对表达量为2.340±0.306,高于NSP和SKOV3细胞,差异有统计学意义。ABCG2基因在SP中表达较NSP细胞高,但差异没有统计学意义。ABCG2基因在SKOV3细胞中相对低表达,较SP和NSP细胞中表达差异有统计学意义(P
研究背景与目的随着社会的进步和经济的快速发展，城市化进程的加速和化境的污染，人们生活方式及饮食结构的发生了明显改变，同时疾病谱也发生了变化。尽管医学的进步，恶性肿瘤的死亡率呈现逐年下降趋势,但各类恶性肿瘤的发病率不断上升，特别是消化系统恶性肿瘤，占有较大比例，如胃癌、肝癌、胰腺癌等。是威胁人类生命的重要因素之一。据统计,每四个死亡病例中就有一个是死于恶性肿瘤[1]。对于肿瘤的研究，发病机制是医学研究的一个热点。MNNG是由人工合成的亚硝基类化合物,替代自然界中的亚硝酰胺类化合物,用来研究在肿瘤形成中的作用。它与胃液中亚硝基物的诱变机制相似。GES-1细胞来源于人,虽然具有永生性,但仍保留了部分正常胃粘膜的特性,如正常的骨架系统、粘蛋白分泌功能、停泊依赖性和裸鼠中非致瘤性等。在MNNG作用下GES-1发生了一些表型改变,如染色体畸变增多、骨架微丝异常、克隆形成率增加,并获得软琼脂集落生成能力[2]。研究已经证实，经MNNG诱导后大部分细胞会逐渐死亡，一周左右时间,GES-1细胞将发生如染色体数目、结构异常,基因重排，幼鼠接种后可致瘤[3]。流行病学证据表明，经常暴露于亚硝胺类饮食的环境中的人们，与胃癌的发生发展密切相关。亚硝胺类物质对人体的致癌性已成为一个全球性健康问题[4、5]。1，25-二羟维生素D3是维生素(Vit)

BGB324 D3经肝、肾代谢后的主要活性形式,有着重要的生物活性,其生物效应是由VitD受体(VDR)介导的。近年来随着国内外学者对1，25-二羟维生素D3的研究不断深入,发现除了维持体内钙环境相对稳定外,还具有调节免疫、抑制肿瘤细胞增殖等十分广泛的作用，1，25-二羟维生素D3具有一定的防癌及抗癌活性,对乳腺癌、肺癌等具有较好的治疗作用[6-7]。 http://www.selleckchem.cn/products/dabrafenib-gsk2118436.html 本实验是通过将体外培养的人胃粘膜上皮细胞系（GES-1），经化学致癌剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG)诱导使细胞恶性转化，研究1，25-二羟维生素D3(骨化三醇)在经MNNG恶性转化的过程中对细胞生长、凋亡及Shh、Gli1基因表达的产生的影响，以便为癌变的机制和预防提供理论依据。 方法 1.分为实验组、对照组和GES-1组。MNNG诱导的GES-1细胞（对照组），诱导后给予不同浓度（10-6、10-7、10-8、10-9mmol/L）1，25-二羟维生素D3进行干预（实验组）。 2.采取四甲基固氮唑盐（MTT）检测实验组和对照组细胞增殖并确定实验组最佳药物浓度。 3.流式细胞仪（flow cytometry）检测各组细胞的凋亡率。 4.RT-PCR检测各组细胞Shh、Gli1mRNA基因的表达。 结果 MTT法显示，对照组细胞出现大量死亡，实验组给予10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的1，25-二羟维生素D3干预后存活细胞较对照组增多（P＜0.05）。取最佳药物作用浓度10-6mol/L为实验组、对照组及GES-1细胞组，FCM测各组细胞7d的凋亡率。分别为实验组(44.73±2.04)%、对照组(85.23±2.08)%、GES-1细胞组(4.9±0.91)%，与对照组相比实验组细胞凋亡明显减少（P＜0.05）。RT-PCR显示ShhmRNA实验组（0.6747±0.0116）、对照组(0.6616±0.0095)均表达（P>0.05），Gli1mRNA实验组（0.3382±0.0150）表达低于对照组（0.5328±0.