0和1.0μM NaAsO2的RPMI1640培养液培养HaCaT细胞48～72h,如此重复培养30代(约15周)后,观察细胞增殖情况和恶性程度；用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24或48h,观察细胞增殖、DNA损伤和细胞凋亡情况。 二、软琼脂集落形成实验 将恶性转化和相关对照的HaCaT细胞与含0.7%低熔点琼脂糖的RPMI1640培养液等体积混合后,铺于含0.7%低熔点琼脂糖的底层培养基上,待其凝固后,表面覆以适量培养液,37;C5%CO2培养,每3-4天换液一次,4周后终止培养并计数细胞集落数。 三、裸鼠皮下致瘤实验 将恶性转化和相关对照的HaCaT细胞按1×107/0.2mL密度注射于Balb/c裸鼠右侧腋窝皮下,饲养4周后将肿瘤组织取出,测量肿瘤体积、固定,并作组织切片、HE染色后进行组织病理学鉴定。 四、逆转录PCR (RT-PCR) 提取细胞总RNA并测定其浓度,逆转录成cDNA后,分别应用mot-2、mdm2、 survivin、CD34和K5引物扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。 五、Western blot 提取细胞总蛋白并测定浓度,用SDS-PAGE分离蛋白、半干法转膜,用特异性一抗4℃孵育过夜,进一步常温结合二抗1h后,用增强型化学发光法检测相关蛋白表达及磷酸化水平。
那个 六、Southwestern blot 提取细胞总蛋白,SDS-PAGE分离、半干法转膜后,将膜变性、复性处理,用生物素标记的κB序列DNA探针与膜杂交,通过化学发光法检测κB序列DNA与NF-κB的结合情况。 七、免疫共沉淀 提取细胞总蛋白,用IP抗体与蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀后,用Western blot法检测蛋白-蛋白相互作用或用Southwestern blot检测DNA-蛋白相互作用。 八、免疫荧光法检测p53的核转位水平 将不同因素处理的HaCaT细胞用兔抗人p53一抗孵育24h后,用Cy3标记的山羊抗兔二抗孵育1h,用DAPI将细胞核染色15mmin后荧光显微镜下观察p53的胞内分布以检测p53的核转位水平。
九、悬浮集落形成实验 将1×104细胞接种至低吸附24孔板中,用含10ng/ml 还有 EGF和10ng/ml FGFβ的无血清DMEM-F12培养液培养,每2天进行一次半定量换液,如此连续培养2周后,镜下观察拍照并计数。 结果 一、亚砷酸钠对HaCaT细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡的影响 用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h;分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞30代(约15周)。结果发现0.5、1.0和2.0μNaAsO2引起HaCaT细胞增殖升高,1.0μM NaAsO2引起增殖最明显,并出现γ-H2AX水平轻度升高；而5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT细胞增殖降低、且γ-H2AX水平和断裂caspase3水平均升高；1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞能在裸鼠皮下形成肿瘤,肿瘤组织病理学切片显示为低分化上皮样癌细胞。结果显示NaAsO2在低浓度引起HaCaT细胞增殖和恶性转化：而在高浓度则引起HaCaT细胞DNA损伤和细胞凋亡。 二、亚砷酸钠对HaCaT细胞p53/survivin和MAPKs及NF-κB信号通路的影响 用0.0、1.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现1.0μMNaAsO2引起HaCaT细胞p-p53水平降低,而p-ERK、p-NF-κB/RelA、survivin和mot-2水平升高；5.0和10.0μM 可能 NaAsO2引起HaCaT细胞p-JNK、p-p38和p-p53水平升高,而survivin水平降低。结果显示NaAsO2在低浓度主要激活ERK和NF-κB信号通路、抑制p53功能而引起survivin和mot-2水平升高,而高浓度则主要激活JNK和p38信号通路、激活p53功能和引起survivin水平降低。
三、MAPKs和NF-κB信号通路在亚砷酸钠对p53的影响中的作用 分别用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126、NF-κB抑制剂Bay11-7082、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580处理HaCaT细胞6h后,再分别用0.0、1.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现阻滞ERK和NF-κB均使1.0μM NaAsO2所致HaCaT细胞p-p53降低回升,且阻滞ERK使1.0μMNaAsO2所致HaCaT细胞核内p53荧光强度降低回升；阻滞JNK则使10.0μMNaAsO2所致HaCaT细胞p-p53水平和核内p53荧光强度升高回降。结果显示ERK和NF-κB信号通路主要参与低浓度NaAsO2所致细胞p53抑制过程,JNK信号通路则主要参与高浓度NaAsO2所致细胞p53激活过程。 四、ERK通过NF-κB调控mot-2和survivin在低浓度亚砷酸钠所致HaCaT细胞恶性转化中的作用 用20.0nM NF-KB/RelA-siRNA和con-siRNA处理HaCaT细胞12h,或用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126处理HaCaT细胞6h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现阻滞ERK信号通路可以阻止低浓度NaAsO2所致NF-κB与κB序列DNA结合能力；关闭NF-kB或抑制ERK均可使1.0μM NaAsO2所致HaCaT细胞mot-2和survivin的：mRNA和蛋白水平升高回降。结果显示低浓度NaAsO2所致HaCaT细胞mot-2和survivin表达上调是通过ERK/NF-κB信号通路完成的。 分别用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126处理HaCaT细胞6h后,再用0.0和1.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24～48h,如此反复处理30代,结果发现阻滞ERK信号通路可阻止1.