05)；雷帕霉素使细胞周期阻滞在G1期,17-AAG亦使细胞周期阻滞在G1期,尤其是作用48h时周期阻滞明显(P<0.0001)；单用雷帕霉素或17-AAG时均可降低蛋白AKT的表达并在一定程度上诱导细胞凋亡(P<0.0001)；联合使用雷帕霉素与17-AAG时可显著降解AKT,明显诱导细胞凋亡,凋亡率明显高于任一单药(P
目的 海绵来源化合物BA是一个具有全新化学骨架结构的抗肿瘤先导化合物,但是其体内外抗肝癌生物学效应及作用机制尚不明确。本研究以人肝癌细胞和裸鼠肝癌移植瘤模型为研究对象,分析海绵来源化合物BA抑制细胞增殖、迁移、诱导细胞凋亡及其作用机制,并探讨BA在裸鼠肝癌模型中的抗肝癌效应及其作用机制。 购买MLN2238 方法 1、体外研究：①BA抑制细胞增殖的效应：MTT比色法检测BA对人肝癌细胞SMMC-7721、Huh-7和HepG2,正常肝细胞L02增殖的影响；②BA抑制细胞迁移的效应：Transwell法检测BA对SMMC-7721细胞的迁移能力；③BA诱导细胞凋亡的效应：H&E染色法鉴定BA诱导SMMC-7721细胞凋亡形态的变化,荧光倒置显微镜与流式细胞术Annexin
V-FITC/PI法分析BA诱导SMMC-7721细胞凋亡作用；Western Blot法检测凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表达变化；④BA抑制细胞增殖、迁移并诱导凋亡的作用机制：Western Blot法检测BA及BA联用LY294002或IGF-1对SMMC-7721细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化。 2、体内研究：①裸鼠肝癌模型的建立：采用1.0×108/m1肝癌SMMC-7721细胞悬液,于裸鼠右腋皮下接种0.1ml,建立肝癌裸鼠模型；②药物干预：裸鼠肿瘤生长至100-150mm3左右,将裸鼠分为4组,以空白溶媒组、5mg/kg和10mg/kg化合物BA组以及10mg/kg5-FU组连续5天腹腔注射给药；③检测指标：监测裸鼠肿瘤大小,计算抑瘤率,评价化合物BA体内抑制肝癌效应；记录裸鼠的体重,研究BA对裸鼠生存质量的影响；眼球取血检测裸鼠肝肾功能；取肿瘤组织以及裸鼠各脏器组织,H&E染色观察肝癌和脏器组织形态变化；④BA体内抗肝癌的作用机制：采用免疫组化和Western
通常 Blot法分析BA对肿瘤组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响。 结果 1、化合物BA的体外抗肝癌效应 ①BA抑制细胞增殖的效应：BA能够抑制系列肝癌细胞株与正常肝细胞L02的增殖,且抑制SMMC-7721细胞增殖呈浓度与时间依赖性关系(p<0.05)。②BA抑制细胞迁移的效应：经BA处理的SMMC-7721细胞的迁移数低于未经BA处理的SMMC-7721细胞组(P<0.05)；呈浓度依赖性关系下调凋亡蛋白Caspase9表达水平(p0.05)；BA联合LY294002或IGF-1对PI3K/AKT信号通路中蛋白表达的作用：在SMMC-7721细胞中,BA联合LY294002组与单用BA和LY294002组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降更显著(p<0.05)；BA联合IGF-1组与单用IGF-1组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降(p
研究目的：探索PcG 很少 (Polycomb Group)家族蛋白的成员之一色素框同源蛋白7(Chromobox Protein Homolog7,CBX7)对胃癌干细胞自我更新能力、克隆增殖能力等干细胞相关特性的调节作用,并探索CBX7调控胃癌干细胞样特性的作用机制。 研究方法：采用无血清悬浮培养的方法从胃癌细胞系中分离出胃癌干细胞样亚群,Western blot检测胃癌干细胞样亚群与贴壁细胞比较干细胞相关因子Oct4.
CD44. CD24及PcG家族蛋白CBX7表达的差异。基因转染下调胃癌细胞中CBX7表达,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot检测基因下调效果,无血清悬浮培养、平板克隆等检测CBX7表达下调后胃癌干细胞样特性的变化。Western blot检测CBX7下调后下游已知靶基因p16、E-cadherin和可能靶基因pAkt、pERK表达变化,RT-PCR检测CBX7下调后miR-21表达改变。同时Western blot检测胃癌悬浮干细胞球与贴壁细胞比较CBX7下游已知靶基因p16及可能靶基因pERK, pAkt表达的差异,RT-PCR检测miR-21表达的差异。在胃癌细胞中下调p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。采用共转染的方法,在胃癌细胞中同时干扰CBX7和p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。 主要结果： 1.MKN28. SGC-7901、NCI-N87胃癌细胞系能在无血清悬浮培养条件下产生干细胞球,而MKN45、HGC-27胃癌细胞系在无血清悬浮培养条件下不能形成干细胞球。MKN28、SGC-7901胃癌悬浮干细胞球较贴壁细胞明显高表达CBX7和干细胞相关因子Oct4, MKN28胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD24,不表达CD44,而SGC-7901胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD44, CD24表达无明显差异。 2.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,胃癌细胞悬浮培养成球率下降,克隆形成率降低。 3.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,SGC-7901细胞中p16、E-cadherin表达上升,且pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变,miR-21则表达下降。MKN28、AGS细胞中pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变。 4. MKN28、SGC-7901胃癌干细胞球与贴壁细胞比较,pAkt表达无明显差异,pERK表达略有下降,SGC-7901胃癌干细胞球低表达p16, western blot未检测到MKN28细胞p16表达,MKN28胃癌干细胞球较贴壁细胞比较miR-21表达无明显变化。 5. ATM/p53在MKN28胃癌干细胞球中表达降低,而在SGC-7901胃癌干细胞球中无明显改变。 6.