gingivalis低毒力株ATCC 33277和高毒力株W83、人脐静脉血管内皮细胞株,建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入HUVEC模型。 2、MTT比色法检测P. gingivalis侵入前后细胞增殖活性变化,流式细胞仪测定细胞周期。 3、Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡率,免疫荧光染色和细胞核DNA阶梯状图谱电泳分析进一步证实细胞凋亡 4、RT-PCR和Western印迹法检测P. gingivalis侵入血管内皮细胞前后ICAM-1、VCAM-1和E选择素基因的mRNA及蛋白表达变化,细胞免疫荧光染色法测定ICAM-1、VCAM-1和E选择素膜蛋白表达。 确认细节 5、Western印迹法检测IκB-α和磷酸化p38 MAPK表达；间接免疫荧光法检测HUVEC NF-κB p65核移位。 6、NF-κB抑制剂MG132和p38 MAPK抑制剂SB203580预处理细胞后,分别建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入模型,分析NF-κB/IκB和p38 MAPK信号通路在P. gingivalis侵入血管内皮细胞影响粘附分子表达过程中的作用。
三、统计分析 结果以均数±标准差(x±s)表示,实验重复3次,采用SAS 8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析,P0.05)；P. gingivalis侵入改变细胞周期分布,使G1期细胞增加(P<0.05),8h显著回落(P0.05)；P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入后4h即诱导ICAM-1、VCAM-1和E选择素膜蛋白表达(P<0.05),ICAM-1和VCAM-1蛋白表达在侵入后8h和24h有持续的高表达(P<0.05)；E选择素蛋白表达在侵入后8h达高峰,侵入后24h仍有较高的表达(P
普通针毛蕨(?)acrothelypteris Selleck PR 171 torresiana (Gaud.) Ching是金星蕨科针毛蕨属植物,主要分布于我国长江以南各省区。由于该植物具有亲热解毒,软坚散结的功效,在民间常被用于止血和治疗水肿。已有文献报道,普通针毛蕨中所含的主要成分Protoapigenone具有良好的抗肿瘤活性,且对诸多肿瘤细胞都表现出明显的细胞毒作用。本实验室研究发现,由该植物首次提取制备的黄酮类化合物2-(顺-1,2-二羟基-4-酮-环己-5-烯)-5,7-二羟基-色原酮(DEDC)是Protoapigenone的结构类似物,对多种肿瘤细胞也呈现出显著的增殖抑制活性。 近年来不断发现,植物黄酮(flavonoids)集许多优良的生理、药理学活性于一身,在癌症及心血管疾病的预防、治疗方面以其天然、高效、低毒的特点而倍受瞩目。黄酮类化合物抗肿瘤机制的报道常常见诸报端,但是总的来说,其具体的防癌、抗癌机理目前尚未明确。近一两年国外研究者在植物黄酮抗肿瘤研究方面取得了突破性的进展,发现许多药物具有的抗氧化与促氧化活性、生物膜保护作用、线粒体毒性损伤、蛋白酶体抑制反应、信号转导抑制与调节功能在抗肿瘤效应及诱导肿瘤细胞凋亡方面起关键作用。
植物黄酮结构上属于多酚类植物化合物,一直被认为是高效的天然抗氧化剂。事实上,植物黄酮作为功能物质起效时,同时具有抗氧化与促氧化两种截然相反的特性。人们通常把植物黄酮对疾病的预防作用归因于其具有良好的抗氧化活性及自由基清除特性。事实上,这些多酚类化合物在抗癌及诱导肿瘤细胞凋亡方面,其促氧化活性起着比抗氧化更为重要的作用。研究表明,这些植物多酚类物质能催化谷胱甘肽(GSH)或辅酶Ⅰ氧化而产生活性氧(ROS),而许多化疗药物能诱导细胞核DNA片段化引起不可逆损伤并促使肿瘤细胞凋亡都是通过ROS介导产生的。
目前,对于黄酮类化合物DEDC的抗肿瘤作用机制并不十分清楚,认为至少可能包括以下两个方面：1.DEDC通过在细胞内的促氧化作用,造成氧化压力,引起氧化应激而损伤生物膜、DNA及其它生物大分子诱导肿瘤细胞凋亡。2.通过在较高浓度下产生ROS调节某些细胞信号转导途径,如：丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs);转录信号传导子与激活子3(STAT3);核转录因子κB (NFκB)等的活性,继而调节细胞生理过程的各个方面,包括细胞的增殖、分化和凋亡 本研究用DEDC处理人肝癌细胞HepG2以及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y后,采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、流式细胞术(flow Apoptosis Compound Library购买 cytometry, FCM)凝胶电泳迁移实验(EMSA)、免疫印迹实验(Western-blot)、和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法分别检测HepG2及SH-SY5Y细胞在DEDC处理后,细胞DNA损伤情况和凋亡相关基因及蛋白表达水平的变化。为了进一步阐明ROS及有关细胞信号分子在肿瘤细胞凋亡中所起的作用, ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC), JNK1/2抑制剂SP600125, P38 MAPK抑制剂SB203580被用于实验,测定ROS、JNK、P38等信号分子在DEDC诱导的HepG2细胞凋亡中起什么作用；同时,NAC和NF-κB抑制剂PDTC被用于检测ROS和NF-κB对SH-SY5Y细胞凋亡的影响。 第一部分DEDC对HepG2细胞毒性作用及其凋亡机制的研究 鉴于黄酮类化合物protoapigenone展示出较强的抗癌活性,本试验旨在探讨其结构类似物2-(顺-1,2-二羟基-4-酮-环己-5-烯)-5,7-二羟基-色原酮(DEDC),种首次从普通针毛蕨分离得到的黄酮类化合物,对肝癌细胞HepG2的生长抑制作用及其诱导凋亡的分子机制,同时为进一步检测了ROS捕获剂NAC及MAPK通路抑制剂对DEDC诱导,实验设计中采取了对细胞预先用不同抑制剂加以处理的方法再观察肿瘤细胞凋亡效应的变化。 将肝癌细胞HepG2和肝正常细胞LO2分别暴露于DEDC (2.5,5, 10μg/ml)或protoapigenone (2.