方法以MTT法检测细胞活力变化;Annexin V/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡;Western blot法检测胞内细胞色素C(Cyt C)的水平;定量RT-PCR检测miR-21的表达水平;通过构建miR-21质粒表达载体并转染乳腺癌细胞上调miR-21的表达。结果细胞活力检测结果表明,木犀草素可显著降低乳腺癌细胞MDA-MB-453的增殖活力;流式细胞凋亡分析和WeSellecksternblot检测结果表明,木犀草素可显著诱导乳腺癌细胞凋亡,并呈现剂量-效应关系;进一步研究显示,木犀草素可显著降低乳腺癌细胞miR-21的表达,而胞内miR-21表达水平的上调可显著降低木犀草素对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用和细胞毒性。结论木犀草素可显著抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其机制涉及对miR-21表达的抑制。”
“目的克隆表达大鼠PD98059DMSO溶解度长链2-羟酸氧化酶。方法以鼠肾cDNA为模板,扩增大鼠长链2-羟酸氧化酶基因,连接到pET-28a(+)载体上构建重组质粒pET28a-rHao2,转化表达宿主Rosetta(DE3)。利用IPTG诱导重组蛋白的表达,并通过Ni柱纯化。通过监测DCIP在605 nm处吸光度值的变化来测定其对经典底物的酶动力学参数,验证活性。结果成功构建了表达质粒以及pET28a-rHao2(β1)和pET28a-rHao2(β2),并诱导表达了大鼠长链2-羟酸氧化酶两种同工酶β1和β2,其对2-羟基辛酸的Km分别为(25.1±1.9)和(24.6±1.2)μmol.L-1;对2-羟基异己酸的Km分别为(24.6±2.3)和(22.4±1.6)μmol.L-1。结论成功克隆表达了大鼠长链2-羟酸氧化酶两种同工酶β1和β2,获得了纯度高,活性好的重组酶,可为其体外底物及抑制剂的筛选提供模型。