在信号转导通路水平探讨罗格列酮对丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)三条信号通路(p38MAPK、 JNK和ERK)激活的影响,用Western的方法检测LPS和罗格列酮作用前后三条通路的磷酸化情况,分析罗格列酮发挥抑制作用可能的途径。 结果： 1.LPS激活BV-2细胞后, TNF-a和iNOS的基因表达显著上调,炎症反应的标志性蛋白iNOS表达增多；应用罗格列酮后,TNF-a和iNOS的基因表达明显下降,TNF-a和iNOS蛋白表达受到抑制,以上结果表明罗格列酮可以在转录水平和蛋白水平抑制炎症介质的产生。

2. NF-κB是机体调控免疫炎症反应的重要转录因子。Western检测发现：LPS激活BV-2细胞后,IKBα表达降低,罗格列酮可以部分恢复IKBα的表达：LPS可以诱导磷酸化NF-κB p65的水平显著升高,罗格列酮作用后可以抑制其升高。另外,NF-κB激活后其p65亚基需进入细胞核与相应DNA特定序列结合而启动炎症介质的表达,免疫荧光染色显示提示罗格列酮可抑制NF-κB的核移位,以上实验结果提示罗格列酮减少炎症介质的释放与抑制NF-κB通路的激活关系密切。 这个 3. MAPKs是与炎症反应密切相关的信号通路,LPS激活BV-2细胞后,p38MAPK、 JNK和ERK通路均发生激活,罗格列酮抑制了p38MAPK和JNK通路的激活,而对ERK的激活无显著影响,说明在信号转导水平,罗格列酮可能通过抑制p38MAPK和JNK通路而发挥抗炎作用。 结论： 罗格列酮可以抑制活化BV-2细胞炎症介质的基因转录,并抑制炎症反应蛋白的表达；在转录因子水平罗格列酮可通过抑制NF-κB活化与核移位而发挥作用；在信号转导水平罗格列酮可通过抑制p38MAPK和JNK的激活而发挥抑制BV-2细胞活化的作用。 总结 本研究利用体外PD炎症模型,系统研究了PPARγ激动剂罗格列酮对小胶质细胞活化的抑制作用及对多巴胺能神经元的保护作用,首次阐明罗格列酮通过抑制NF-κB、

Romidepsin订单 p38MAPK和JNK通路的激活而发挥抗炎作用。另外,本研究首次利用小胶质细胞系BV-2细胞的条件培养液在MN9D细胞上模拟了炎症损伤,直观显示了炎症介质对多巴胺能神经元造成的氧化应激和线粒体功能障碍,两者是导致多巴胺能神经元退变凋亡的主要机制,并证实罗格列酮抑制炎性介质释放与保护多巴胺能神经元的高度相关。本研究深化了罗格列酮抑制小胶质细胞活化药理机制的认识,为TZDs类药物治疗PD提供了新的实验依据。
研究背景： 神经系统疾病是全球首位致残疾病和第3位主要致死因素。如脑中风会引起大脑损伤区域神经元和神经元连接广泛缺失,导致长期的神经功能障碍。目前药物干预主要局限在急性期的脑损伤保护,如重组组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)仅适合于急性期恢复脑供血等。尚不能对中风引起的长期神经功能障碍起到有效的治疗和恢复作用。因此,寻找能有效恢复损伤后亚急性其和慢性期神经功能的治疗方法,药物或保健食品意义都非常重大 在我国,海参一向被视为药食两用的海产佳品,其中尤以剌参为佳。刺参广泛应用于年老体弱者,记忆力减退着,中风患者术后以及神经退行性疾病患者的保健和恢复。可见刺参对预防神经衰退,增强和恢复神经组织功能发挥积极作用,且食用刺参没有副作用。所以,深入研究刺参活性成分的药理作用对发挥刺参在维护人民身体健康方面具有重要的意义,同时也为刺参产业的发展起积极的作用。本研究从刺参体壁中分离获得具有药理活性的刺参多糖,探讨其对神经细胞的作用方式及其作用机制。 实验方法： 1.刺参多糖的分离纯化、活性筛选和理化性质鉴定 实验采用为蛋白酶/胰蛋白酶双酶解法,乙醇沉淀获得粗多糖,大孔吸附树脂脱色,用DEAE-sepharose阴离子交换柱分离,获得A、B、C、D四个多糖组分,用Sephacryl S-200凝胶进一步春华并脱盐。将分离获得的组分分别用神经干细胞球迁移实验(HS-3活性最好)和星形胶质细胞活化进行活性筛选(HS-4活性最好)。选取有活性的单一糖组分进行理化性质鉴定，采用HPLC法做纯度检查，自动旋光仪检测比旋光度，苯酚硫酸法检测总糖含量，硫酸咔唑法检测糖醛酸含量,明胶BaCl2法检测硫酸根含量, 很少 Bradford法检测蛋白质含量,凝胶色谱法检测多糖分子量。 2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。 本实验从孕14.5天胎鼠大脑皮层分离神经干细胞,培养在含EGF、FGF-2的培养基中。相差显微镜测量HS-3在基础培养基中(无EGF/FGF-2)促进神经干细胞球迁移的距离,用Hoechst/PI双染法检测细胞存活情况,用BrdU labeling法检测细胞的增殖状态,免疫荧光法观察神经干细胞在含HS-3的培养基中的分化状态,用信号通路抑制剂(P13K抑制剂LY294002,

ERK抑制剂PD98059,BMP抑制剂noggin)、Western blotting和RT-PCR技术检测HS-3诱导细胞粘附和迁移可能的作用机制。 3、HS-4与FGF-2协同诱导星形胶质细胞活化作用研究 星形胶质细胞活化主要包括三个方面：1)细胞形态变化；2)细胞由静息期进入细胞分裂期,细胞增殖；3)细胞发生迁移。本实验从新生大鼠大脑中经胰酶消化分离,机械振荡法纯化获得星形胶质细胞。首先通过MTT法检测HS-4对细胞的毒性作用以确定后续试验的使用浓度和作用时间。用伊红染色和免疫荧光染色法观察HS/FGF-2诱导细胞的形态变化,western blotting检测星形胶质细胞特征蛋白GFAP的表达情况。BrdU插入法检测细胞增叭,流式细胞术检测细胞周期变化情况,Western blotting检测细胞周期调控蛋白ICyc D1农达水平Transwell法检测HS-4/FGF-2促进细胞迁移作用。用细胞通路各抑制剂(Rho通路抑制剂Y27632, PI3K抑制剂LY294002, ERK抑制剂PD98059,P38抑制剂SB203580, JNK抑制剂SP600125)、免疫荧光和Western blotting技术检测HS-4/FGF-2诱导细胞形态变化可能的作用机制。 实验结果： l、刺参多糖的分离纯化与理化性质鉴定 本实验通过离子交换色谱分离获得四个多糖组分,经细胞活性检测确定HS-3具有促进神经干细胞球迁移和分化作用：HS-4对诱导星形胶质细胞活化的作用效果最为显著经鉴定,HS-3的理化性质为：HPLC检测确定其为均一物质,分子量约为1.79×102Da,旋光度为[α]D20-48.62°(c0.1, H2O),总糖含量为57.18%,酸性多糖含量为12.39%,SO42-含量为29.75%。HS-4的理化性质为：分子量为4.23×105Da,总糖含量为38.12%,酸性多糖含量为16.52%,硫酸根含量为32.64%,单糖组分主要以岩藻糖为主,还含有小部分半乳糖,不含蛋白质和核酸。 2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。 从胎龄为E14.