01,P<0.05),表明RIP2表达质粒成功转染SW480细胞；大肠杆菌感染SW480细胞后,随着时间的推移,胞内的大肠杆菌数量也随之增长,说明大肠杆菌在SW480细胞内的生长呈增加趋势；将大肠杆菌刺激细胞24h后,转染RIP2细胞组的活菌数较转染空质粒组和未转染质粒组胞内活菌数数量明显减少,其差异有统计学意义(P<0.01),蛋白表达水平较对照组增高(P
目的:丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinase, MAPKs)是细胞内广泛存在的一类含丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶,介导细胞生长、发育、分裂、凋亡等多种生理过程。p38

MAPK是MAPKs家族的一个亚型,大量研究发现,p38 MAPK信号传导通路与脑缺血损伤及脑缺血耐受诱导有着密切联系。我们既往的研究结果表明,在体脑缺血预处理通过引起星形胶质细胞谷氨酸转运体-1 ( glial glutamate transporter-1, GLT-1)大量表达而诱导脑缺血耐受,但脑缺血预处理引起GLT-1大量表达的机制目前尚不清楚。脑缺血预处理是否通过p38 MAPK信号转导通路诱导GLT-1大量表达而发挥脑保护作用目前尚未见相关报道。因此,本实验旨在观察脑缺血耐受诱导过程中,p38 MAPK激酶对大鼠海马CA1区谷氨酸转运体GLT-1蛋白表达的影响,探讨脑缺血预处理是否通过p38 MAPK通路诱导GLT-1蛋白大量表达而发挥保护作用,从而为将来脑缺血性疾病的防治提供理论依据。 购买EPZ-6438 方法:健康雄性Wistar大鼠(280～320g)300只,随机分为以下三部分: 1脑缺血预处理对p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白表达的影响 除control组之外,其余大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行假手术或脑缺血处理,具体分组如下:①control组(n=5);②sham组(n=45):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;③脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP)组(n=45):夹闭双侧颈总动脉3 min,然后恢复血流再灌注;④损伤性缺血(ischemic insult, II)组(n=45):夹闭双侧颈总动脉8 min,然后恢复血流再灌注;⑤CIP+II组(n=45):夹闭双侧颈总动脉3 min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。除control组之外的其余各组,又分为9个时间点,即假手术或末次缺血后0

min、15 min、30 min、3 h、6 h、1 d、2 时间 d、4 d、7 d(每个时间点n=5)。 在规定的时间点,断头取海马脑组织,硫堇染色进行神经病理学评价;应用Western blot法观察p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白的表达。2 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导的影响 具体分组如下:①sham组(n=5);②CIP组(n=5);③II组(n=5);④CIP+II组(n=5);⑤SB203580+sham组(n=15):暴露颈动脉前30分钟右侧脑室注射p38 MAPK特异性抑制剂SB203580,其余步骤同sham组;⑥3% DMSO+CIP+II组(n=5);暴露颈动脉前30分钟右侧脑室注射3%DMSO

20μl,其余步骤同CIP+II组;⑦SB203580+CIP+II组(n=15):脑缺血预处理前30分钟右侧脑室注射SB203580,其余步骤同CIP+II组。其中,⑤、⑥、⑦组根据SB203580剂量不同,又分成1.25 nmol、2.5 nmol、5n mol 3个亚组,每个亚组n=5。 末次缺血或假手术后7天取材,应用硫堇染色观察海马CA1区病理学分级和神经元密度,探讨p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导的影响。 3 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导过程中GLT-1蛋白表达的影响 具体分组如下:①3% DMSO+CIP+II组(n=30);②SB203580+CIP+II(n=60)。根据设计,脑缺血预处理前30分钟侧脑室注射3% DMSO或SB203580,然后夹闭双侧颈总动脉3 min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8 selleck screening library min作为损伤性缺血,而后恢复再灌注。根据SB203580剂量不同,又分成2.5 nmol、5 nmol两个亚组,每个亚组n=30。 于末次缺血后即刻(0 min)、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d时取海马脑组织(每个时间点n=5),应用western blot法观察GLT-1蛋白的表达,探讨抑制p38 MAPK信号转导通路对GLT-1蛋白表达的影响。 结果: 1在脑缺血耐受诱导过程中,大鼠海马CA1区p-p38 MAPK蛋白和GLT-1蛋白的表达及其时间对比 Western blot分析显示,control组大鼠海马CA1区有一定量的GLT-1蛋白的基础表达。但control组大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白的基础表达极低。 与control组相比,sham组GLT-1的表达在各时间点均有所上调,IOD比值在各时间点均明显升高(P0.05),从3 h时间点开始降低,随着时间的推移逐渐降低,以4 d、7 d时间点最明显(P0.05)。第二次高峰从缺血后6 h开始逐步升高,到4 d时达到其峰值,7 d时依然很高(P0.05)。p-p38MAPK的western blot分析显示,p-p38MAPK在早期即0 min、15 min、30 min、3 h时间点表达非常明显(P0.05)。 II组大鼠在2天内未见CA1区明显的锥体神经元损伤;7 d时,细胞形态发生明显改变,几乎全部神经元死亡或缺失,ND值为17±8.06,与sham组相比,HG明显升高(P<0.01),ND明显降低(P<0.01),ND值为180±11.67、明显升高(P0.05)。 3% DMSO+CIP+II组的大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐,形态完整,未见损伤。与CIP+II组相比,HG、ND(189±11.03)均无显著差别(P>0.