抑制ILK显著加重心脏缺血再灌注室性心律失常发生;2.ILK激动剂可明显减轻再灌注室性心律失常的严重程度,而且该效果可被ILK抑制剂所消除。第二部分:Cx43在ILK保护缺血再灌注室性心律失常中的作用1.ILK活性调节剂预处理后各组心肌组织总的Cx43的蛋白表达水平无明显改变。2.ILK激动剂可稳定心脏缺血再灌注后Cx43在闰盘处的分布,相反,ILK抑制剂可促进心脏缺血再灌注后Cx43的侧面化,并阻断ILK激动剂抑制Cx43重新分布的作用。第三部分:Akt在ILK调控Cx43重塑中的作用Akt抑制剂预处理后再予ILK激动剂处理发现,Akt抑制剂可拮抗ILK激动剂的抗缺血再灌注室性心律失常的作用,同时阻断ILK激动剂稳定Cx43闰盘分布的作用。结论:1.ILK具有改善大鼠缺血再灌注室性心律失常的作用;2.ILK发挥抗心律失常的机制与抑制Cx43重新分布有关;3.ILK抑制Cx43重新分布通过激活Akt473位点的磷酸化来实现。
高脂血症引起的以肥胖、胰岛素抵抗、高血压等为表现的代谢综合征的发病率逐年升高,并呈年轻化趋势,其可导致大血管病变发病风险的增加。在高血脂作用下,内皮功能发生紊乱,其主要机制是血管内皮合成释放的各种血管活性物质和细胞因子二者之间的平衡被打破。内皮功能紊乱被认为是促进大血管病变早期发生发展的主要因素。因此,改善内皮功能紊乱并阻止其进展将会有效降低代谢综合征的发病率。k-阿片受体(k-opioid Afatinib供应商 receptor,k-OR)在心血管系统中广泛表达。心脏可产生并释放内源性k-阿片肽,其可作用于k-OR从而调节心血管系统的活动。我们课题组既往的研究发现:①激活k-OR能够以时间、剂量以及内皮依赖性的方式舒张大鼠的腹主动脉,在整体可以显著降低正常和高血压大鼠的动脉血压;②激活k-OR可上调低氧条件下NO的水平,同时抑制内皮素(ET-1)和血管紧张素II(Ang

II)的表达,并可改善低氧诱导的肺动脉内皮功能紊乱;③激活k-OR还可以抑制心肌缺血导致的炎症反应和心肌细胞凋亡。这些作用均与NO的生成密切相关,提示k-OR的激活可能具有内皮依赖性的舒张血管、调节血管舒张/收缩因子的平衡状态、改善内皮功能以及抗炎等作用。然而,关于k-OR在高脂引起的内皮损伤中的调节作用及分子机制尚不明确,因此,本课题在前期工作的基础上,成功构建了高脂诱导的内皮细胞凋亡模型,观察k-OR在改善高脂诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用及其可能的分子机制。研究结果可为治疗高脂血症引起的内皮损伤提供新的策略。【目的】1.在高脂诱导的内皮凋亡模型中,阐明k-OR的激活对内皮细胞生物学行为的影响;2.揭示k-OR的激活对内皮细胞生物学行为产生影响的具体分子机制。【材料与方法】1.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经培养和鉴定后,用软脂酸钠(sodium

也许 palmitate)高脂诱导细胞损伤48小时后进行后续实验。2.分组情况如下:正常对照组;高脂处理组;高脂处理+U50,488H(选择性k-OR激动剂)组;高脂处理+U50,488H+nor-BNI(选择性k-OR拮抗剂)组。3.采用光学显微镜观察各组细胞生长状态。4.采用油红染色分析各组细胞脂滴合成情况。5.采用细胞活力测定试剂盒(CCK-8)评价各组细胞生长活力。6.采用双染色法,通过流式细胞技术分析各组细胞凋亡比率。7.采用特异性抑制剂和小干扰RNA分别处理细胞,通过Western blot法检测各组细胞中k-OR、p-Akt、total-Akt、p-e NOS、total-e NOS、Caspase 3等分子的蛋白表达情况。8.利用一氧化氮检测试剂盒,检测各组细胞培养上清中NO的含量。【结果】1.k-OR的激活对高脂诱导的HUVEC生物学行为的影响Sodium 很少 palmitate处理48小时后,高脂处理组细胞数目减少,细胞形态发生变化,呈典型的凋亡形态,细胞中脂滴含量增加;同时,细胞生存率明显下降,凋亡显著上调。U50,488H可以显著改善高脂诱导细胞的生长状态,降低细胞中脂滴的含量,提高细胞生存率,抑制细胞凋亡。上述作用可被κ-OR拮抗剂nor-BNI所阻断,表明U50,488H是通过激活κ-OR,并可能介导了下游信号通路的活化,继而引发了一系列细胞生物学行为的改善。2.κ-OR的激活在改善高脂诱导的内皮细胞凋亡中的可能机制实验表明U50,488H可通过激活k-OR并活化PI3K-Akt-e

NOS信号通路,进而促进NO的生成,同时抑制Caspase 3的表达,从而抑制高脂诱导的细胞凋亡。为进一步验证抗高脂诱导的细胞凋亡的作用是由κ-OR介导的,并且是通过PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化实现的,本实验利用针对κ-OR和Akt的si RNA处理细胞,结果表明转染针对κ-OR的si RNA后高脂诱导的细胞凋亡显著增加,转染针对Akt的si RNA后可以阻断U50,488H的抗凋亡作用。上述结果表明,κ-OR介导的抗高脂诱导的细胞凋亡的作用与PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化有关。【结论】本研究首次提出κ-OR激动后能够通过介导PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化,提高e NOS的生物活性,促进NO的生成,从而抑制高脂诱导的细胞凋亡。研究结果为临床应用阿片类物质防治高脂诱导的内皮损伤提供了理论依据,同时为防治高脂血症与代谢综合征向心血管疾病的发展提供了新的思路及策略。
背景乳腺癌是威胁妇女身心健康的常见恶性肿瘤,目前发病率排在女性恶性肿瘤的第一位,死亡率排在第六位。化疗是乳腺癌综合治疗的重要步骤之一,但化疗可以使乳腺癌细胞产生多药耐药,从而导致化疗失败。研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, P13K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)(AKT)信号传导通路的激活参与了乳腺癌的多药耐药过程。因此,PI3K-AKT信号通路被认为是重要的乳腺癌治疗靶点,一些PI3K-AKT信号传导通路的小分子抑制剂已经进入临床研究阶段,在乳腺癌的靶向治疗方面显示出了良好的应用前景。MK-2206是人工合成的高选择性非ATP竞争的特异性的新型小分子AKT抑制剂,在多种肿瘤中都显示出了较好的肿瘤抑制效果,目前已进入到Ⅱ期临床研究阶段。目的本实验以乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞为研究对象,在细胞水平初步探讨MK-2206对其杀伤及逆转作用,验证拮抗p-(Thr246)PRAS40的表达能否部分逆转乳腺癌细胞的阿霉素耐药,为乳腺癌的临床用药提供依据。方法1.细胞培养：培养人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞,阿霉素维持浓度为1ug/mL.实验前两周,对MCF-7/ADR进行无药培养。取对数生长期细胞进行实验。2.CCK-8检测：利用CCK-8法检测阿霉素和MK-2206对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性、耐药倍数以及MK-2206逆转MCF-7/ADR耐药的作用。3.流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测无毒剂量的MK-2206联合阿霉素作用于MCF-7/ADR细胞后,其凋亡率的变化以及MCF-7/ADR细胞内阿霉素含量的变化。4.