07倍,提示SKBR3/TDR对MK-2206无耐药性。不同浓度的MK-2206与trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明显,差异具有统计学意义(P0.05)(图7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR细胞内的蓄积。3. Western Blot检测结果显示MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。与对照组相比,不同浓度的MK-2206处理SKBR3/TDR和SKBR3细胞后,均可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达,且呈剂量依赖性(图8、图9),实验组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明了联合应用trastuzumab和MK-2206的有效性。结论通过建立裸鼠HER2阳性乳腺癌模型及相关动物实验,结果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。MK-2206与trastuzumab联合应用可以下调p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌trastuzumab耐药。P-PRAS40-Thr246是一个新型的乳腺癌治疗靶点,为逆转trastuzumab耐药的研究提供帮助。
目的：肝细胞肝癌(Hepatocellular
ATM激酶抑制剂体内 carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一,在男性癌症死亡率中居于第二位。肝脏切除、肝移植、局部消融等治疗方式使肝癌的治愈成为可能,但多数肝癌患者有肝硬化背景,在发现时已经处于病程的中晚期,仅有30%～40%的患者适合该治疗,且其术后5年的复发率高达70%。介入化疗栓塞等只能暂时缓解肝癌患者的临床症状,并不能有效显著改善患者的预后。索拉菲尼(sorafenib),一种多蛋白激酶抑制剂,具有抗血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重作用,是治疗进展期肝癌的一线用药。但是由于肝癌复杂的生物学特性,通过其内在的或获得的机制造成对索拉菲尼的耐药,导致索拉菲尼治疗进展期肝癌效果极其有限。但索拉菲尼治疗失败后尚无有效的化疗药物可以应用,因此探讨索拉菲尼耐药的机制对于改善进展期肝癌患者的预后显得迫切和重要。在中国,大约75%的肝癌患者患有乙型病毒性肝炎,持续的慢性肝脏损伤刺激星形细胞和成纤维细胞,形成肝脏的纤维化,纤维化最终发展为肝硬化。肝硬化破坏了肝脏正常的血液供应,导致肝脏血流循环减少,形成局部缺氧的微环境；从肝脏一般性腺瘤样增生、不典型腺瘤样增生到早期癌的演变中,细胞的快速增殖也会造成肿瘤局部缺氧。索拉菲尼在抑制肿瘤新生血管生成的同时,又加重了肿瘤内部的缺氧。而肿瘤内部的缺氧微环境(hypoxic
microenvironment)加剧了肿瘤细胞基因的不稳定性并诱导肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)相关蛋白的表达,造成肿瘤对化疗和放疗的耐受。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)是肿瘤缺氧反应中的关键因子,其通过调控肿瘤能量代谢、新生血管形成、增殖、浸润和转移等相关基因的转录和表达,决定着肿瘤的发生发展。因此下调缺氧诱导因子、促进它的降解或抑制它的功能等,都可以阻断缺氧诱导反应,达到抑制肿瘤的效果。HIF是由α亚单位和p亚单位组成的异构二聚体,属于碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子家族成员。HIF主要包括HIF-1α和HIF-2a,尽管二者有48%的同源氨基酸序列,结构相似,但其不同之处正在不断被发现。HIF-la在急性缺氧环境下被激活并稳定表达,但随着缺氧时间的延长其蛋白表达水平逐渐降低直至消失,相反HIF-2a的含量随着缺氧时间的延长持续增加。缺氧诱导的基因如VEGF在急性缺氧期是HIF-1a的靶基因,而随着缺氧时间的延长主要由HIF-2a激活。与HIF-1a广泛分布不同,HIF-2a仅能在特定细胞如肝细胞内表达。肝细胞内的血管生成素基因主要由HIF-2a调控,而灭活HIF-2a可以抑制VHL相关肝血管瘤的生长。同HIF-1a相比,HIF-2a可能在肝癌发生发展中发挥更加重要作用,是治疗肝癌的一个潜在靶点。就HIF-2a在肝癌发生发展中的作用人们做了初步的探讨,多数研究认为HIF-2a促进肝癌的发生发展,然而也有少数研究提示HIF-2a对肝癌的进展具有负调节作用,表明HIF-2a在肝癌发生发展中的作用存在争议,这从另一方面也反映了HIF-2a在肝癌发生发展中的作用机制是复杂的。研究表明,肿瘤特异性的缺氧微环境可能与索拉菲尼的耐药相关,但其确切的机制尚未完全阐明。因此,我们设计实验研究HIF-2a在肝癌发生发展中的作用,探索缺氧微环境下索拉菲尼的耐药机制,这样不仅可以进一步完善肝癌发生发展分子机制理论,而且有望为提高索拉菲尼治疗肝癌的疗效提供潜在的靶点。方法：1.应用免疫组织化学及免疫印迹方法检测肝癌肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721中HIF-2a蛋白的表达,分析HIF-2a蛋白表达水平与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系。2.既往的研究表明：缺氧培养的肝癌细胞系同常氧培养相比其索拉菲尼IC50显著增高,提示缺氧增加了肝癌细胞系对索拉菲尼的抵抗。为进一步研究是HIF-1a还是HIF-2a影响了缺氧微环境下肝癌对索拉菲尼的治疗效果,本课题应用Western
Onalespib GDC-0449供应商 blot观察索拉菲尼治疗前后肝癌细胞系中HIF-1α、HIF-2a的表达。体外实验和裸鼠成瘤实验观察HIF-2a封闭前后索拉菲尼对肿瘤细胞增殖能力的影响,探讨HIF-2a在索拉菲尼耐药中的作用。3.采用细胞免疫化学和TOP-Flash荧光素酶报告实验观察HIF对Wnt/β-catenin经典信号通路活性的影响。4.采用基因干扰技术检测HIF-2α封闭前后及c-Myc封闭前后Wnt/β-catenin通路中关键蛋白的表达,分析缺氧环境中HIF-2α表达与Wnt/β-catenin信号通路间的关系。Western blot分析肝癌移植瘤模型中对照组、索拉菲尼治疗组、HIF-2α shRNA组及联合组中HIF-2α、Wnt/β-catenin通路中关键基因的表达,深入探讨缺氧微环境中索拉菲尼耐药的分子机制。结果:1. Western blot分析发现,肝癌组织中HIF-2α的蛋白表达水平明显高于癌旁组织中HIF-2a的蛋白表达水平(P<0.05)。与HIF-1α不同,HepG2细胞经索拉菲尼处理后其HIF-2α蛋白的表达量较未处理组增加1.7倍,经统计学检验,具有统计学意义(P<0.