体外培养HTCFs及鉴定：于青光眼滤过术中取患者的Tenon’s囊组织,采用组织块培养法进行HTCFs的原代培养。并对HTCFs进行传代培养。免疫细胞化学染色法对细胞进行波形蛋白抗体及角蛋白抗体的染色，鉴定所培养的细胞是否为成纤维细胞。 2.MTT法检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFs增殖的影响：分别在细胞接种后的第24h、第48h以及第72h进行MTT比色试验，检测不同浓度的GBE（25、50、100、200mg/L）对TGF-β1(2ng/L)诱导的HTCFs增殖的影响。
3.流式细胞仪检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFs细胞周期的影响:实验分为3组（n=3），分别为对照组、TGF-β1（2ng/ml）组， GBE（200mg/L）+TGF-β1（2ng/L）组,于接种后72h收集细胞，流式细胞仪检测各组细胞周期，细胞周期分析软件MultiCycle分析DNA数据，计算HTCFs增殖指数（proliferadtion index，PI）,PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。 4.免疫细胞化学染色法检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFsα-SMA表达的影响：实验分组同上,于细胞接种后72h收集细胞，免疫细胞化学SABC法检测各组α-平滑肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）的表达情况。 5.RT-PCR检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFsCTGFmRNA表达的影响：实验分组同上,于细胞接种后72小时收集细胞，RT-PCR检测各组CTGFmRNA的表达。 结果：1.HTCFs易于体外培养，细胞增殖活跃，传代后性状稳定，免疫细胞化学波形蛋白抗体染色阳性，角蛋白染色阴性，证实所培养的细胞为成纤维细胞。 2.TGF-β1能有效促进HTCFs的增殖，随着GBE（25、50、100、200mg/L）浓度的增加及作用时间的延长，HTCFs的增殖活性逐渐增强（p
研究目的
还有 雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)是一种用于治疗骨质疏松的新型药物,它具有使大鼠骨髓间充质干细胞(rat http://www.selleck.cn/products/azd6738.html bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)向成骨细胞方向转化的作用,除此之外,它还有改善骨强度,促进新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)和P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路调节成骨细胞特异性转录因子Runx2(Cbfal)的转录活性,Runx2则调节下游成骨基因,如骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅱ型胶原(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的表达,促进BMSCs的成骨分化。 转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一,它有着极其广泛的生物学功能,不仅调控rBMSCs的生长发育和分化,而且能促进rBMSCs向成骨细胞的发育和转化,调控成骨细胞的生长发育和增殖,在合成骨基质和形成骨重建方面也起着重要的作用,是调控rBMSCs生长发育和向成骨细胞分化的首选的生长因子之一；它还可参与调控多种细胞的生长发育和生物学功能。相关资料表明,TGF-β1可能在锶促进rBMSCs向成骨细胞分化的过程中起着重要的作用。但是,TGF-β1在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中的作用如何迄今未见报道。本文旨在重点探讨：①Sr对rBMSCs的TGF-β1表达的影响；②TGF-β1是否在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中起作用,以便为Sr的促成骨作用机制提供新颖的实验资料。 研究方法
1.建立rBMSCs体外分离、培养的方法体系。 取四周龄,雌雄不限SD大鼠,取出大鼠双侧的股骨,胫骨,用全骨髓贴壁的方法分离出rBMSCs,用含培养液的10m1注射器从大鼠骨髓中将rBMSCs从骨髓中冲洗出来,直至骨髓腔发白,将收集好的细胞悬液离心,去上清,置于25cm2培养瓶中,并于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱培养,当细胞铺满瓶底80%左右时进行传代培养和适当的冻存。并取第3-5代的细胞用于实验。用倒置显微镜观察细胞生长发育状态,并鉴定所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 2.定向诱导rBMSCs向成骨细胞分化 取生长状态良好的第3-5代rBMSCs,调整其浓度为105/ml左右,取细胞悬液4ml接种,并用成骨诱导液(含10-8的地塞米松,0.2mM的维生素C,10mMβ-甘油磷酸钠)培养,当细胞融合达到60%-70%时,进行实验操作。 3.实验分组 (1)碱性磷酸酶(ALP)指标测定的实验分组 ①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs,分别为对照组、Sr=0.1、Sr=l、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM,每组设5复孔,六组均在成骨诱导液条件下诱导rBMSCs7天。当Sr=3mM时,ALP活性最大。 那个 ②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液培养；Sr+SB组：Sr+SB431542+成骨诱导液：先用10gmol/L SB431542(TGF-β1抑制剂)预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO组：DMSO+成骨诱导液,用10μmol/LDMSO培养；共培养rBMSCs7天,测定ALP活性。 (2)茜素红钙结节染色的实验分组 ①分为两组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组：用成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液,共培养21天。 ②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液；Sr+SB431542组：Sr+SB431542+成骨诱导液,先用10gmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO+成骨诱导液组：用10μmol/LDMSO培养：共培养rBMSCs21天,测定钙结节数目。 (3)TGF-β1蛋白表达的实验分组 ①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs.分为对照组、Sr=0.