IPO实验IPO干预细胞后Oh、12h、24h分别利用AO-EB法测定细胞平均坏死率,分别观察RSV单独和联合IPO时减轻心肌细胞I/R损伤的作用。 2. RSV联合IPO对p38 MAPK/PPARy/AP-1通路影响IPO后12h,利用Western blotting技术检测p38

MAPK蛋白表达、磷酸化情况,PPARγ、AP-1蛋白表达情况。采用半定量RT-PCR技术检测p38 MAPK、cyclinA2 mRNA表达情况。观察RSV干预后再进行IPO时MAPK信号转导途径的变化。 3. p38 MAPK抑制剂对保护作用及上述通路的影响在以上五组基础上增加RSV+SB+IPO组。RSV+SB+IPO组：给予p38 MAPK抑制剂SB203580 20min, RSV20min,给予IPO。IPO后12h,利用AO-EB法测定细胞平均坏死率,Western blotting技术检测PPARγ、AP-1蛋白表达情况。采用半定量RT-PCR技术检测cyclinA2 mRNA表达情况。观察抑制p38 MAPK对RSV联合IPO的保护作用的影响,以及下游分子PPARγ、AP-1蛋白表达变化。 结果： 1. RSV单独和联合IPO时均可减轻心肌细胞I/R损伤用IPO干预H9c2(2-1)细胞0h、12h、24h后,各时间点IPO组细胞平均坏死率均低于I/R组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。PPARy蛋白水平：SB+RSV+IPO组低于RSV+IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。AP-1蛋白水平：SB+RSV+IPO组高于RSV+IPO组,差异有显著统计学意义(P
免疫抑制剂具有重要的临床应用价值,广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗,常见的免疫抑制剂有糖皮质激素、维生素D3、环孢素A、雷帕霉素、它克莫司等。这些免疫抑制剂在临床应用的过程中,在产生治疗效应的同时,也具有一定的副作用,因此,研发新的具有治疗作用的免疫抑制剂意义重大。作为我国传统医学中的瑰宝,中草药对疾病的预防和治疗作用,尤其是对炎症、感染、肿瘤、自身免疫、移植排斥等疾病的预防和治疗作用,主要是通过免疫系统实现的。中药中很可能存在具有免疫抑制作用的成分,发现这些成分并研究其功能具有理论和应用价值。由于树突状细胞(Dendritic

Kinase 抑制剂 Library cells, DCs)是机体免疫应答中的关键细胞,该类细胞也很可能是免疫抑制剂的主要的靶细胞,因此,以DCs作为靶细胞很可能筛选到具有抑制作用的中药成分。鉴于此,我们课题组与第二军医大学药学院张卫东教授课题组合作,利用基于DCs分化发育和功能成熟的药物筛选平台,从496种中药单体化合物中成功筛选出18类31个有效单体成分。并选择对DCs分化发育抑制率较高,而本身的细胞毒性较小,且能有效促进DCs分泌IL-10的免疫抑制性的丝毛瑞香的提取物Lariciresinol(分子式C20H2106)作为研究对象,深入研究该成分对DCs的调控及其机制；并使用过敏性自身免疫反应性脑脊髓膜炎(EAE)模型研究了其在体内应用的有效性。 因为 (一)中药单体化合物Lariciresinol对DCs功能的影响 以本身的细胞毒性较小,且能有效促进DCs分泌IL-10的Lariciresinol成分为研究对象,研究了Lariciresinol对DCs的凋亡诱导作用、对DCs吞噬功能、成熟表型、细胞因子分泌、激发同种异体免疫反应和抗原提呈能力的影响。

我们以GM-CSF和IL-4诱导小鼠骨髓细胞生成DCs,并使用药物处理第五天的未成熟DCs24小时,再用终浓度为100ng／ml的LPS刺激24小时,检测相应指标。使用FACS检测annexinV和PI的方法确定了16nmol／ml为Lariciresinol对未成熟DCs的无毒性浓度范围。后期的研究发现,Lariciresinol不能影响DCs的吞噬和分泌IL-12P70、TNF-α和TGF-β的能力,却能明显促进抑制性细胞因子IL-10的分泌,并能抑制DCs激发同种异体免疫反应(MLR)和特异性抗原提呈能力。 (二)中药单体化合物Lariciresinol促进DCs分泌IL-10的机制 研究 IL-10是一种重要的具有免疫负调节作用的细胞因子。Lariciresinol是如何促进IL-10分泌的呢?进一步实验发现,Lariciresinol对DCs分泌IL-10的促进具有Lariciresinol浓度梯度依赖性和LPS的浓度梯度依赖性。那么,促进的信号通路如何呢?我们采用Western Blot技术,Lariciresinol处理第五天的未成熟DCs 24小时,再加入终浓度为100ng／ml的LPS,并在第0、15、30和60分钟,裂解细胞,收集蛋白检测ERK1／2、p38和JNK的磷酸化情况,发现Lariciresinol能够明显增强ERK1／2的磷酸化；ERK1／2信号通路抑制剂PD98059能够抑制Lariciresinol对DCs的IL-10分泌促进作用,另外,p38信号通路抑制剂SB203580,亦能抑制Lariciresinol促进的IL-10分泌作用。由此,证明了Lariciresinol通过ERK1／2信号通路促进DCsIL-10的分泌,而对P38信号可能具有基础性的活化作用。 Apoptosis抑制剂 (三)中药单体化合物Lariciresinol处理的DCs过继转移和Lariciresinol体内注射均能抑制自身免疫病的发生 既然,Lariciresinol可以明显促进DCs分泌IL-10的能力,并能部分抑制DCs的成熟和抗原提呈能力,那么,Lariciresinol:处理的DCs能否通过诱导免疫耐受而抑制自身免疫病的发生呢?Lariciresinol直接体内注射,又如何呢?本部分研究中,我们通过小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型,对其抑制作用进行了研究。 以MOG35-55多肽作为抗原,辅以腹腔注射百日咳毒素,成功地建立C57BL／6小鼠的EAE模型。其中抗原肽诱导建立的EAE组小鼠发病率达到95%,平均临床打分为3.16±0.