2 mg/mL 也许 Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性反应；利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价到第四次免疫时达到顶峰,其抗体滴度在1:10 240以上。 重组蛋白能诱发新西兰兔产生迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity, DTH),注射部位出现明显红肿,红肿部位皮肤温度比对侧相应部位高,于注射后6-1Od红肿消退,生理盐水对照部位未见反应；经Tp0751重组蛋白刺激后的巨噬细胞LDH漏出率和NO释放量较低,和6-His-Tag蛋白作用组比较,差异无统计学意义,与蛋白刺激浓度无关。

Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,其能以剂量和时间依赖方式诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6的最适Tp0751刺激浓度为5μg/mL,Tp0751刺激细胞6h后即可从培养基中检测到TNF-α、IL-1β和IL-6,随着刺激时间的延长炎症因子的产生量逐渐增加,而刺激48h(TNF-α、IL-1β)和24 h(IL-6)产生的量则达到高峰。TLR2抗体、CD14抗体能明显抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的产生,并且TLR2和CD14抗体联合处理组对于CKs产生的抑制率明显高于单独处理组；SAPK/JNK特异性抑制剂SP600125对TNF-α、IL-1β和IL-6的产生无明显影响；ERK1/2特异性抑制剂PD98059能较低程度抑制TNF-a的产生,但对IL-1β和IL-6的产生无明显影响；而p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂PDTC能明显抑制TNF-a, IL-1β和IL-6的产生,且呈剂量依赖关系；Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,Western blot能检测到明显的磷酸化的SAPK/JNK、p38和ERK1/2条带,60 min达到高峰(P-JNK 45 min后达到高峰),随后逐渐下降,可持续到90

min以上(P-JNK 60 min后基本消失)；同时Western blot检测结果表明,NF-ΚB抑制剂PDTC能部分抑制NF-κB从胞浆转位至胞核,而未用PDTC处理的细胞核抽提物中发现Tp0751重组蛋白能明显激活NF-κB,在细胞核中能检测到明显的NF-κB蛋白条带结果。 1)成功构建了pET-28a(+)-Tp0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了高含量的相对分子量约为26 kDa的可溶性融合蛋白； 2)Tp0751重组蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体； 3) Tp0751重组蛋白诱发新西兰兔产生明显的DTH反应； 4) Tp0751重组蛋白对THP-1细胞无明显的细胞毒性作用； 5) Tp0751重组蛋白可以诱导THP-1细胞以时间和剂量依赖方式表达CKs(IL-1β、TNF-α和IL-6),可能为TP的一个新的重要的致病因子； 6)Tp0751重组蛋白诱导THP-1表达CKs的信号传导可能与TLR2和CD14途径有关； 7)Tp0751重组蛋白能激活THP-1细胞内的MAPKs和NF-κB,从而表达CKs。
炎症反应在动脉粥样硬化、肿瘤等疾病的发生发展过程中具有重要作用。致炎因子和细胞因子可通过细胞膜受体激活胞内多条信号通路,进而诱导转录因子活化,调节下游靶基因的表达活性,最终导致细胞行为的改变,并且该过程贯穿动脉粥样硬化和肿瘤形成的诸多阶段。临床流行病学资料也证实,以抗炎为靶标的治疗措施能有效降低动脉粥样硬化等心血管疾病和多种肿瘤的发病风险。因此,寻找或者合成具有较强抗炎活性的先导化合物对于治疗心血管及肿瘤相关性疾病具有重要意义。 CP-690550 UMI-77半抑制浓度 欧亚旋覆花属菊科植物,属辛温之药,入肺、大肠经,具有消痰、行水、降气、止呕、抗菌、消炎和镇痛之功效,主要用于治疗胸中痰结、胁下胀满、咳喘、呃逆、心下痞硬、大腹水肿等症。构—效分析表明,从欧亚旋覆花中分离提取的活性单体——大花旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL),可通过阻断核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路抑制炎性因子诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的炎症应答,对损伤引起的血管内膜增生具有明显的预防作用;6位引入酯酰基的1,6-O2-ABL具有更强的抗炎作用。细胞的过度增殖是炎症诱发血管狭窄和肿瘤形成的主要病理机制,ABL除了抑制炎症应答外,是否能够直接抑制细胞的过度增殖尚不清楚。本研究从细胞和整体水平上系统观察了ABL及其修饰衍生物对VSMC和乳腺癌细胞增殖的抑制效应,进而探讨其作用机制。旨在挖掘ABL新的药理效应,为扩展药物研发提供依据。

1 ABL抑制血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)诱导的VSMC增殖及其机制 动脉粥样硬化、冠状动脉血管成形术后再狭窄等慢性炎性病变主要涉及血管内膜的损伤并由此导致的VSMC的迁移和增殖。局部炎症引起血小板聚集,暴露于管腔的VSMC以及内皮细胞在各种因素的刺激下可释放出多种细胞因子。其中,PDGF可通过活化细胞内信号转导途径从而促进VSMC迁移和增殖,在血管新生内膜形成过程中起着重要作用。本研究证实ABL通过阻断PDGF激活的ERK1/2信号级联而抑制DNA的合成,抑制VSMC增殖,并且诱导细胞凋亡。 1.1 ABL抑制PDGF诱导的VSMC DNA合成和细胞增殖 采用BrdU掺入实验发现,给予PDGF(20 ng/ml)刺激VSMC 24 h后,细胞增殖活性明显增高。而ABL(5、10、20μM)与PDGF共同作用24 h后,VSMC增殖活性明显下降。细胞计数分析也观察的相似的实验结果。而单独应用10μM ABL处理VSMC 24 h,细胞的DNA合成和增殖活性未见明显改变。提示ABL可抑制PDGF诱导的VSMC增殖而对静止的细胞无影响。 1.2 ABL使PDGF诱导VSMC的细胞周期停滞于G1期 流式细胞术分析显示,ABL(10、20μM)与PDGF(20 ng/ml)共同作用VSMC 24 h后,处于G1期的细胞数较PDGF组明显增加,与此同时,S期细胞数目明显减少。提示ABL抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用与细胞周期进程被阻滞于G1期有关。 1.