3%,泌尿道感染次之30例占21.4%;感染病原菌以革兰阴性菌为主,占70.0%,其次为革兰阳性菌占29.3%;革兰阳性菌对青霉素G药率最高,达78.0%,对林可霉素、环丙沙星、阿奇霉素次之;革兰阴性菌对青霉素耐药率最高,达77.6%,其次为林可霉素、阿奇霉素、环丙沙星;真菌对氟康唑有着较高的耐药率,为55.5%。结论对肺癌医院感染患者病原菌特点及其耐药性进行分析,了解其耐药性,针对感染不同种类细菌使用相对耐药性较低的药物可有效治疗患者发生肺部感染,能促进临床合理使用抗菌药物、提高感染控制效率、改善患者生存质量有着重要的临床意义。
目前发现的ALK阳性肿瘤已从间变性大细胞淋巴瘤扩展到弥漫性大B细胞性淋巴瘤、非小细胞肺癌、炎性肌纤维母细胞瘤、神经母细胞瘤、未分化间变性甲状腺癌及其他少见类型的癌和肉瘤。正确诊断ALK阳性肿瘤和判断ALK阳性表达的亚细胞定位对肿瘤ALK重排的类型、肿瘤的诊断与鉴别诊断、预后判断及指导ALK抑制剂的个体化靶向治疗具有重要意义。本文主要对ALK阳性肿瘤的临床病理学特点、病理发生、ALK信号转导通路及ALK靶向治疗现状进行介绍。
目的探讨非小细胞肺癌(nonsmall-cell

lung cancer,NSCLC)组织中棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule 和 associated protein like 4-anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因与胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TYMS)mRNA表达的关系。方法应用实时荧光定量PCR方法检测257例NSCLC组织中EML4-ALK融合基因、TYMS mRNA的表达。结果非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因阳性率占4.28%(11/257),在不吸烟患者中较高(P<0.05)。结论非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因阳性患者TYMS倾向低表达,可能从一线化疗药的培美曲塞中受益。
目的:介绍分子靶向药物治疗非小细胞肺癌的策略。方法:依据文献综述分子靶向药物治疗非小细胞肺癌的原理、一线及二线用药原则、未来分子靶向治疗药物的研究方向。结果与结论:治疗非小细胞肺癌需设计合理有效的一线及二线靶向治疗措施;未来肿瘤治疗的方向将是针对肿瘤细胞的特定靶点的个体化靶向治疗。
目前胃癌的细胞毒药物治疗已进入一个平台期。随着分子生物学研究的深入开展,胃癌的诊断及治疗进入了分子水平。大量的基础和临床研究正在探索胃癌的分子靶点包括:人表皮生长因子受体2、人表皮生长因子受体1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2、纤维母细胞生长因子受体2、肝细胞生长因子受体以及聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶等。目前,仅有人表皮生长因子受体2的靶向药物曲妥珠单抗及血管内皮生长因子受体2靶向药物ramucirumab被III期临床研究证实在晚期胃癌中有显著疗效,针对上述靶点的其他药物需进一步研究和开发。
生物标志物对于疾病的鉴定、早期诊断和预防,以及治疗过程中的监控具有重要作用。寻找和发现有价值的生物标志物已成为目前研究的一个热点。汤森路透Cortellis临床试验情报将生物标志物的发现与针对当前常见疾病的相关临床试验关联,提供描绘临床图景关键元素和当前趋势的专家分析,从而指导临床开发决策。
间变大细胞淋巴瘤(ALCL)是一种临床上少见的恶性淋巴瘤。形态学存在着一种标志的hall

Talazoparib半抑制浓度 mark细胞;细胞免疫学上CD30(Ki-1)表达强阳性;标志性的染色体异常t(2;5)(p23;q35)。临床诊断时多为疾病晚期(Ⅲ~Ⅳ期),并常伴有B症状。成人患者,推荐采取放疗,同时辅以联合化疗;儿童患者病程类似Burkitt淋巴瘤,治疗方案一般使用高强度的治疗淋巴母细胞白血病或Burkitti淋巴瘤的方案。高危ALCL、复发难治ALCL可应用CD30单克隆抗体和ALK蛋白抑制剂等。临床上报道较少,对其认识仍有不足。近年来虽然对ALCL的研究取得了显著的进展,但至今尚未形成成熟规范的治疗方案。未来研究有望最终寻找到ALCL的最优化治疗方案。现就其在免疫和遗传学、形态学、临床表现、治疗和预后等方面的研究进展作一综述。
蛋白激酶是细胞内信号转导通路网络的关键组成部分,调节细胞生长、分化、代谢及生存等重要生物学过程。激酶组(kinome)是指细胞或组织中所有激酶的总称。激酶组学(kinomics)是研究激酶组的学科,包括激酶的丰度、活性、底物特异性、磷酸化状态及氨基酸突变。目前人激酶组由568种基因编码组成,其中约50%激酶定位于疾病基因位点。由于基因扩增或突变引起的蛋白激酶活性失调与许多疾病的发生相关,包括炎症、糖尿病及各种肿瘤,因此,人激酶组被认为是药物靶点的潜在资源库。靶向激酶的小分子抑制剂已成功用于肿瘤治疗。化学蛋白质组技术是一种新的深入研究激酶组的方法,是将亲和富集与质谱技术相结合,在生理状态下研究激酶丰度及磷酸化水平。通常情况下,将一个或多个广谱小分子激酶抑制剂偶联于固相载体(如琼脂糖凝胶),亲和富集细胞或组织中的所有激酶,然后通过质谱鉴定或定量。该方法可用于激酶抑制剂药物或药物候选物的靶点专一性及耐药机制研究,为深入研究药物作用机制及寻找联合用药新靶点提供依据。对人激酶组及肿瘤激酶组无偏见、全景式分析能帮助发现更多新药靶点,以及激酶活性谱与肿瘤治疗的相关性,为个体化治疗提供依据。本文对人激酶组、激酶、激酶抑制剂与肿瘤的关系,基于化学蛋白质组的激酶组学研究进展及其在药物研究中的最新应用进行综述。
Pancreatic

也许 ductal adenocarcinoma is the 4th leading cause of cancer deaths in the United States.The majority of patients are candidates only for palliative chemotherapy,which has proven largely ineffective in halting tumor progression.One proposed mechanism of chemoresistance involves signaling via the mesenchymalepithelial transition factor protein(MET),a previously established pathway critical to cell proliferation and migration.Here,we review the literature to characterize the role of MET in the development of tumorigenesis,metastasis and chemoresistance,highlighting the potential of MET as a therapeutic target in pancreatic cancer.

2 mg/mL 也许 Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性反应；利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价到第四次免疫时达到顶峰,其抗体滴度在1:10 240以上。 重组蛋白能诱发新西兰兔产生迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity, DTH),注射部位出现明显红肿,红肿部位皮肤温度比对侧相应部位高,于注射后6-1Od红肿消退,生理盐水对照部位未见反应；经Tp0751重组蛋白刺激后的巨噬细胞LDH漏出率和NO释放量较低,和6-His-Tag蛋白作用组比较,差异无统计学意义,与蛋白刺激浓度无关。

Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,其能以剂量和时间依赖方式诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6的最适Tp0751刺激浓度为5μg/mL,Tp0751刺激细胞6h后即可从培养基中检测到TNF-α、IL-1β和IL-6,随着刺激时间的延长炎症因子的产生量逐渐增加,而刺激48h(TNF-α、IL-1β)和24 h(IL-6)产生的量则达到高峰。TLR2抗体、CD14抗体能明显抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的产生,并且TLR2和CD14抗体联合处理组对于CKs产生的抑制率明显高于单独处理组；SAPK/JNK特异性抑制剂SP600125对TNF-α、IL-1β和IL-6的产生无明显影响；ERK1/2特异性抑制剂PD98059能较低程度抑制TNF-a的产生,但对IL-1β和IL-6的产生无明显影响；而p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂PDTC能明显抑制TNF-a, IL-1β和IL-6的产生,且呈剂量依赖关系；Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,Western blot能检测到明显的磷酸化的SAPK/JNK、p38和ERK1/2条带,60 min达到高峰(P-JNK 45 min后达到高峰),随后逐渐下降,可持续到90

min以上(P-JNK 60 min后基本消失)；同时Western blot检测结果表明,NF-ΚB抑制剂PDTC能部分抑制NF-κB从胞浆转位至胞核,而未用PDTC处理的细胞核抽提物中发现Tp0751重组蛋白能明显激活NF-κB,在细胞核中能检测到明显的NF-κB蛋白条带结果。 1)成功构建了pET-28a(+)-Tp0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了高含量的相对分子量约为26 kDa的可溶性融合蛋白； 2)Tp0751重组蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体； 3) Tp0751重组蛋白诱发新西兰兔产生明显的DTH反应； 4) Tp0751重组蛋白对THP-1细胞无明显的细胞毒性作用； 5) Tp0751重组蛋白可以诱导THP-1细胞以时间和剂量依赖方式表达CKs(IL-1β、TNF-α和IL-6),可能为TP的一个新的重要的致病因子； 6)Tp0751重组蛋白诱导THP-1表达CKs的信号传导可能与TLR2和CD14途径有关； 7)Tp0751重组蛋白能激活THP-1细胞内的MAPKs和NF-κB,从而表达CKs。
炎症反应在动脉粥样硬化、肿瘤等疾病的发生发展过程中具有重要作用。致炎因子和细胞因子可通过细胞膜受体激活胞内多条信号通路,进而诱导转录因子活化,调节下游靶基因的表达活性,最终导致细胞行为的改变,并且该过程贯穿动脉粥样硬化和肿瘤形成的诸多阶段。临床流行病学资料也证实,以抗炎为靶标的治疗措施能有效降低动脉粥样硬化等心血管疾病和多种肿瘤的发病风险。因此,寻找或者合成具有较强抗炎活性的先导化合物对于治疗心血管及肿瘤相关性疾病具有重要意义。 CP-690550 UMI-77半抑制浓度 欧亚旋覆花属菊科植物,属辛温之药,入肺、大肠经,具有消痰、行水、降气、止呕、抗菌、消炎和镇痛之功效,主要用于治疗胸中痰结、胁下胀满、咳喘、呃逆、心下痞硬、大腹水肿等症。构—效分析表明,从欧亚旋覆花中分离提取的活性单体——大花旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL),可通过阻断核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路抑制炎性因子诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的炎症应答,对损伤引起的血管内膜增生具有明显的预防作用;6位引入酯酰基的1,6-O2-ABL具有更强的抗炎作用。细胞的过度增殖是炎症诱发血管狭窄和肿瘤形成的主要病理机制,ABL除了抑制炎症应答外,是否能够直接抑制细胞的过度增殖尚不清楚。本研究从细胞和整体水平上系统观察了ABL及其修饰衍生物对VSMC和乳腺癌细胞增殖的抑制效应,进而探讨其作用机制。旨在挖掘ABL新的药理效应,为扩展药物研发提供依据。

1 ABL抑制血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)诱导的VSMC增殖及其机制 动脉粥样硬化、冠状动脉血管成形术后再狭窄等慢性炎性病变主要涉及血管内膜的损伤并由此导致的VSMC的迁移和增殖。局部炎症引起血小板聚集,暴露于管腔的VSMC以及内皮细胞在各种因素的刺激下可释放出多种细胞因子。其中,PDGF可通过活化细胞内信号转导途径从而促进VSMC迁移和增殖,在血管新生内膜形成过程中起着重要作用。本研究证实ABL通过阻断PDGF激活的ERK1/2信号级联而抑制DNA的合成,抑制VSMC增殖,并且诱导细胞凋亡。 1.1 ABL抑制PDGF诱导的VSMC DNA合成和细胞增殖 采用BrdU掺入实验发现,给予PDGF(20 ng/ml)刺激VSMC 24 h后,细胞增殖活性明显增高。而ABL(5、10、20μM)与PDGF共同作用24 h后,VSMC增殖活性明显下降。细胞计数分析也观察的相似的实验结果。而单独应用10μM ABL处理VSMC 24 h,细胞的DNA合成和增殖活性未见明显改变。提示ABL可抑制PDGF诱导的VSMC增殖而对静止的细胞无影响。 1.2 ABL使PDGF诱导VSMC的细胞周期停滞于G1期 流式细胞术分析显示,ABL(10、20μM)与PDGF(20 ng/ml)共同作用VSMC 24 h后,处于G1期的细胞数较PDGF组明显增加,与此同时,S期细胞数目明显减少。提示ABL抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用与细胞周期进程被阻滞于G1期有关。 1.

tuberculosis administration. Conclusions/Significance:These data reveal a role for TLR9 in the immune response to opioids during M. tuberculosis infection. Opioids have been widely applied in clinics as one of the most potent pain relievers for centuries, but their abuse has deleterious physiological effects beyond addiction. We previously reported that opioids inhibit

cell growth and trigger apoptosis in lymphocytes. However, the underlying mechanism by which microglia apoptosis in response to opioids is not yet known. In this study, we show that morphine induces microglia apoptosis and caspase-3 activation in an opioid-receptor dependent manner. 时间 Morphine decreased the levels of microglia phosphorylated Akt (p-Akt) and p-GSK-3β(glycogen synthase kinase 3 beta) in an opioid receptor dependent manner. More interestingly, GSK-3βinhibitor SB216763 significantly increased morphine-induced apoptosis in both BV-2 microglia and mouse

primary microglial cells. Moreover, co-treatment of microglia with SB216763 and morphine led to a significant synergistic effect on the level of phospho-p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). In addition, 所以 inhibition of p38 MAPK by its specific inhibitor SB203580 significantly inhibited morphine-induced apoptosis and caspase-3 activation. Taken together, our data clearly demonstrates that morphine induces apoptosis in microglial cells, which is mediated via GSK-3βand p38 MAPK pathways.
目的：(1)体外培养骨髓间充质干细胞,并鉴定骨髓间充质干细胞。(2)通过检测电磁场对骨髓间充质干细胞成骨分化指标的影响,研究电磁场促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的效应。(3)研究电磁场对骨髓间充质干细胞向成脂肪分化影响。(4)研究电磁场对骨髓间充质干细胞信号通路的影响,并探讨电磁场激活的信号通路同电磁场促成骨效应间的联系。 方法：用梯度离心+反复贴壁培养法培养和纯化骨髓间充质干细胞,取纯度较高且活性良好的P4-P6代细胞作为我们研究的靶细胞。 (1)采用多向分化诱导和流式细胞检测骨髓间充质干细胞表面标志物等方法对所取骨髓间充质干细胞进行鉴定,以确定所取细胞为骨髓间充质干细胞。

(2)通过PNPP法检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR和实时定量PCR检测骨髓间充质干细胞多种成骨指标：ALP、RUNX2、BMP2、BSP、DLX5的表达,免疫组化检测Ⅰ型胶原的表达,Von Kossa染色法检测钙结节的形成等方法探讨电磁场促进骨髓间充质干细胞成骨分化的效应。 (3)通过RT-PCR和实时定量PCR检测成脂肪指标的表达、western blot检测PPARγ蛋白的表达,油红O染色检测脂肪滴的形成,检测电磁场对骨髓间充质干细胞成脂肪分化的影响。 Fludarabine数据表 (4)通过Western Blot、ELISA等方法检测电磁场对MAPK、AKT、cAMP-PKA等信号通路的影响,找出相关激活的信号通路及作用位点。 (5)通过加入信号通路抑制剂或激动剂,检测在抑制或活化信号通路的条件下电磁场促成骨效应的变化,探讨电磁场激活的信号通路同其促成骨效应间的联系。 结果：(1)所取细胞在倒置显微镜下观察呈成梭形或多角形,有较好的折光性；生长迅速,常成簇状,集落状生长。在成骨诱导培养基作用下21天后可形成大量钙结节,在成脂肪诱导培养基作用下14天后有大量脂肪滴的形成。流式鉴定结果显示,CD90+,CD45-；CD29+,CD45-的表达率均在95%以上,而CD45+阳性的表达率小于5%,这表明其基本不含造血细胞系,细胞均一性良好,符合骨髓间充质干细胞表面标记物特征。 (2)电磁场作用三天后明显促进碱性磷酸酶活性的表达,促进Ⅰ型胶原的表达,多种成骨指标：ALP、BMP2、DLX5、BSP、RUNX2等mRNA的表达在电磁场作用三天后表达明显升高。在成骨诱导培养基的作用下,15天和21天钙结节染色电磁场作用组较对照组钙结节数目明显增多。 (3)RT-PCR及实时定向PCR显示电磁场作用下,成脂肪分化指标PPAR-γ2、adipsin、AP2等mRNA下调;PPAR-γ2蛋白表达下调；脂肪滴的形成减少。 (4)电磁场作用细胞15min、30min、60min、120min后检测cAMP、PKA、ERK1/2、P38、JNK.

SB203580对小鼠巨噬细胞系TNF-α产生的抑制效应与低氧和p38 MAPK活性的关系 (1)正常氧状态下SB203580抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α产生的剂量关系实验 RAW264.7细胞分别用25μM和10μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS10、100及1000 ng/ml,另外一组RAW264.7细胞分别用1-20μM SB203580预处理2h,然后加入LPS 1ng/ml或者用0.2-2μM SB203580预处理2

h,然后加入LPS 0.1ng/ml,正常氧状态下细胞继续孵育18 h,收集上清液。 (2)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-α产生的抑制效应实验 RAW264.7细胞培养液加入10μM SB203580培养2 h后加入LPS 1 ng/ml,细胞分别在正常氧、低氧(0.5%O_2)和氯化钴(100μM)模拟低氧环境孵育18 h,收集上清液。 (3)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-αmRNA转录活性及mRNA稳定性的影响实验 RAW264.7细胞处理同上,加入LPS培养2 EPZ-6438购买 h后,用Trizol方法提取细胞RNA。 另设实验组在加入LPS 2 h后再加入2μg/ml转录抑制剂Actinomycin D,加入Actinomycin D的时间点为0时,在10、30和60 min时间点用Trizol收集细胞RNA。 (4)正常和低氧浓度环境下SB203580抑制效应的动态监测实验 RAW264.7细胞用10μM SB203580预处理2 h,在正常氧和氯化钴(100μM)模拟低氧环境下向细胞培养液中加入LPS 1ng/ml,加入LPS的时间点记为0时,在加入LPS后1、2、4、6、8h收集上清液。 (5)低氧对p38 MAPK及其底物MAPKAPK2活性影响实验 RAW264.7细胞经10μM Protein Tyrosine激酶抑制剂 SB203580预处理2 h后,在正常氧浓度和低氧模拟环境接受LPS 1ng/ml刺激,LPS加入的时间点记为0时,在10、30、60 min收集细胞蛋白质。 2.低氧影响SB203580抑制小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α产生作用的实验 向原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养液中加入20μM或10μM SB203580,2 h后加入LPS 1ng/ml或10 ng/ml,细胞在正常氧及氯化钴(100μM)模拟低氧环境下孵育18 h,收集上清液。 以上细胞实验均设无SB203580预处理对照组和溶剂对照组。 3.动物模型实验 (1)正常氧环境下不同剂量LPS对小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受腹腔注射0.5-3.5 mg/kg LPS 90 min后处死,留取标本。 (2)正常氧环境和低氧环境下SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受静脉注射SB203580 15、25 mg/kg,2 h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,将小鼠置于正常氧环境下或者低氧坏境(10%O_2),注射LPS后90

min处死小鼠,留取标本。 (3)SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平及肺HIF-1α表达的影响 小鼠经静脉注射SB203580 15 mg/kg,2h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,在注射LPS后90 min和240 min处死,留取血清和肺组织标本。 以上动物实验均设溶剂对照组和生理盐水对照组,每组3只小鼠。 3.实验标本处理方法 (1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培上清液和小鼠血清TNF-α水平; (2)Real-time PCR定量检测TNF-αmRNA转录水平; (3)Western blot检测p38 MAPK活性和下游底物MAPKAPK2蛋白表达; (6)RT-PCR和Real-time PCR检测小鼠肺组织HIF-1αmRNA的表达; (7)Western blot检测小鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达; (8)免疫组织化学染色(IHC)检测小鼠HIF-1α蛋白在肺组织中的表达及分布情况。 研究结果

1.正常氧状态下RAW264.7对LPS的刺激非常敏感。0.1 ng/ml低剂量至1000ng/ml高剂量LPS均可使RAW264.7细胞产生大量的TNF-α,比未经处理的RAW264.7细胞中TNF-α基本值增加10倍以上。SB203580对LPS诱导RAW264.7细胞产生的TNF-α具有非常明显的抑制效果,可以抑制90%以上TNF-α的产生,并且呈剂量依赖方式,高于SB203580 selleck公司 10μM或1μM的剂量均能有效抑制LPS1 ng/ml或0.1 ng/ml刺激RAW264.7细胞产生的TNF-α,低于这个剂量则对相应LPS刺激产生的TNF-α无明显抑制作用。 2.在无LPS刺激的情况下,低氧(0.5%O_2)或者氯化钴模拟低氧刺激仅使TNF-α的基线值大约升高2倍(p＜0.05,n=3)。与正常氧浓度下相比,LPS在低氧浓度状态下刺激TNF-α产生仅有微小的增加(无统计学意义),并且氯化钴具有很好的模拟低氧的效果。SB203580(10μM)不但可以在正常氧浓度下完全抑制LPS诱导的TNF-α产生(p＜0.05,n=3),而且可以抑制单独由低氧诱导的TNF-α产生。但是在低氧或者氯化钴模拟低氧状态下观察不到SB203580对LPS诱导的TNF-α蛋白表达的明显抑制作用。 3.SB203580能降低TNF-α在正常氧浓度状态下的转录水平(p＜0.05,n=3)。低氧和氯化钴刺激能提高LPS诱导的TNF-αmRNA表达,从而对抗SB203580的抑制作用。 4.低氧状态下LPS刺激TNF-α产生增多和达到峰值水平的时间比正常氧浓度状态下均提早约2 h。SB203580在正常氧浓度状态下可以抑制TNF-α的产生一直维持在基线水平;SB203580在低氧浓度下抑制TNF-α产生的动态曲线与正常氧浓度下LPS单独刺激的诱生曲线平行。 5.Western blot结果显示,在正常氧浓度下,磷酸化有活性的p38 MAPK(p-p38)可在加入LPS后10min检测到,30 min达到峰值状态,60 min有所减弱。在氯化钴模拟低氧状态下可观察到p-p38类似的表达模式。但在不同氧状态下SB203580并没有影响p38和p-p38的表达量。 在正常氧浓度状态下,磷酸化的MAPKAPK2(p-MK2)在接受LPS刺激10min可检测到,30 min检测到p-MK2最大量的表达,60 min表达衰减。低氧状态下p-MK2在30和60 min时间点的表达量比正常氧浓度状态下明显增加,而SB203580对此表达模式没有明显影响。 6.Real-time PCR比较显示低氧可以提高TNF-αmRNA的稳定性。分析TNF-αmRNA在30 min时间点的相对表达量,SB203580在正常氧浓度下并不影响TNF-αmRNA的稳定性(p＞0.05,n=3),在低氧状态下可以一定程度的降低其稳定性(p＜0.05,n=3)。 7.

将收集的细胞提取蛋白,使用western blot法检测EL的表达。 4.以上数据使用统计学进行分析。 结果 1. AngⅡ可以上调HUVECs EL的表达。HUVECs经AngⅡ刺激后,在4,8,12h时其EL的表达量分别为0.362±0.041,0.738±0.034和0.387±0.051,均较0h(0.254±0.027)时明显增加,均p
背景： 高血压为最常见的慢性病,在其发生、发展的进程中,可导致心血管系统、脑、肾脏等多器官并发症,严重威胁着人类健康。心肌纤维化(myocardial

也许 fibrosis,MF)作为高血压病心肌损害的主要病理基础,表现为心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)胶原的过度沉积和肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)数目的增多,进而影响心室壁动度及心室的舒张及收缩功能,从而导致严重心律失常、心功能不全及心源性猝死等严重并发症。因此,高血压心肌纤维化的发生机制和防治措施已成为近年来国内外研究热点。 近来研究发现MF是一个复杂的病理过程受免疫系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和多种细胞因子调控。而炎症因子作为参与调控MF的重要因素在其发生、发展进程中发挥重要作用。 在诸多的细胞因子中,TNF超家族作为一个有多重生物学效应的促炎反应因子,与多种疾病发生、发展过程密切相关。TNF是一组具有多样生物学效应的促炎反应细胞因子,参与多种疾病的发生、发展。如：TNF-a表达升高可导致心功能不全及心肌病并且TNF-a还参与糖尿病大鼠心肌炎症反应及纤维化。作为TNF超家族中的新成员肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK),于1997年发现其主要由淋巴样细胞表达,在其合成之初为Ⅱ型膜结合蛋白,随后很快被furin酶水解成具有生物学活性的可溶性的小片段。Fnl4主要由非淋巴样细胞,如上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞中表达,作为TWEAK特异性相关受体为人们所熟知,是Ⅰ型跨膜蛋白。TWEAK和Fn14广泛表达于各种组织及细胞内,在胰腺、肠、心脏、大脑、肺、卵巢及骨骼肌中均有TWEAKmRNA的表达,在肝脏及肾脏中亦少量表达。近年TWEAK及其特异性受体Fn14在创伤修复及组织再生方面介导多种炎症反应受到越来越多的关注,TWEAK作为一种促炎及促血管生成的细胞因子介导多种细胞的生长、增殖、凋亡,促炎性反应和血管生成等作用。研究发现TWEAK与其受体Fn14结合主要通过核转录因子(nuclear

factor-KB, NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated Dinaciclib订单 protein kinase, MAPK)、蛋白激酶B (protein kinase B,PKB)途径等多个下游信号通路的瀑布样反应发挥作用。随着研究深入,TWEAK与其受体Fn14促进AS、MF及介导心肌重塑等在心血管系统过程中所发挥的的作用越来越得到重视。TWEAK/Fn14能促进内皮功能不全、增强炎症反应、促进平滑肌细胞增殖及迁移、上调MMPs表达、促进细胞死亡,参与动脉粥样硬化斑块进展,促使其不稳定,进而导致急性冠脉综合征的发生。在ST段抬高型急性心肌梗死病人时血清可溶性TWEAK (sTWEAK)显著升高,其升高程度与病人的短期预后密切相关。在心肌纤维化方面,研究发现在自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR)心肌中Fn14表达明显增强,Fn14可能参与SHR心肌纤维化的过程,培哚普利可能通过抑制其表达减轻心肌纤维化。进而在体外细胞水平发现TWEAK/Fn14明显促进CFs中NF-κB和MMP9mRNA及蛋白表达,而以PDTC抑制NF-κB通路后,CFs增殖降低且MMP9表达减少。进而揭示TWEAK通过激活经典的NF-κB通路能促CFs增殖和胶原合成,参与心肌纤维化的发生、发展过程发现。Chen等研究发现TWEAK通过激活经典的NF-κB通路,促进大鼠CFs增殖和Ⅰ/Ⅲ胶原合成,促进心肌纤维化进展。然而,在心肌纤维化方面相关研究发现,TWEAK作为一种具有多种活性的炎症因子,除能激活经典的NF-κB通路外,还可通过介导Fn14激活非经典的NF-κB通路以及MAPK通路,然而相关研究未见报道。因此,本文通过观察TWEAK介导P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activated

很少 protein kinases, P38MAPK)通路对大鼠心肌成纤维细胞中胶原代谢影响,及MMP-1表达的影响,以进一步明确TWEAK参与心肌纤维化的机制。 目的： 探讨肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)影响心肌成纤维细胞(CFs)中Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)表达的作用机制。 方法： 1.采用胰蛋白酶消化法及时间差法培养并纯化新生Wistar大鼠心肌成纤维细胞。并采用倒置显微镜及波形蛋白免疫荧光法观察并鉴定心肌成纤维细胞。 2.加入重组人TWEAK(rhTWEAK)及P38MAPK抑制剂(SB203580)干预。 将实验分为①对照组：不加干预因素；②TWEAK组：加入100ng/mLTWEAK;③TWEAK+SB203580组：加入100ng/mLTWEAK+SB203580。 3.各实验组分别采用MTT法检测CFs增殖；western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白及磷酸化P38MAPK(P-P38MAPK)蛋白表达；qRT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达；ELASA法检测CFs细胞培养液中MMP-1的浓度。 结果： 1.CFs的形态观察及鉴定 培养48h后,CFs已长满或接近长满单层培养瓶,长满或接近长满单层。于倒置显微镜下观察,CFs多呈梭形,无自发性搏动。其细胞核较大,胞浆透明。采用波形蛋白免疫荧光鉴定,CFs的波形蛋白呈现阳性反应,其胞浆内围绕胞核呈现绿色网络状物质。 2.干预因素对CFs增殖的影响 rhTWEAK干预心肌成纤维细胞48h后,对照组(0.302±0.019),TWEAK组(0.493±0.042), TWEAK+SB203580组(0.362±0.039)三者间相比较,TWEAK组较对照组可显著促进CFs增殖,差异有统计学意义(P0.05)。SB203580干预组及未干预组比较,CFs增殖程度降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。在特异性阻断P38MAPK通路后,其Ⅰ型胶原mRNA表达水平较TWEAK组降低,二者间差异有统计学意义(P<0.05),见图3a。与对照组比较,二者Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高差异(P<0.05)。同TWEAK组相比,TWEAK+SB203580组中Ⅰ型胶原蛋白较其减少42.6%,差异有统计学意义(P<0.01)。TWEAK+SB203580组与对照组相比,TWEAK+SB203580组部分抑制P-P38MAPK蛋白表达(P<0.

05mg/kg,2次/天,连续8天,灌胃),术前一天开始给药,术后第8天开始每日半量减药,第13天停止给药。术后7天、14天、21天、28天、35天及42天对移植肝组织进行雄性性别决定基因Sry原位杂交染色,对移植肝组织进行免疫组化CD44、ICAM-1、Fas及CD40染色,计算各组大鼠的中位生存时间(MST),检测肝功能(ALT,DBil,GGT,ALP,XCHE,ALB)、血液细胞因子(IL-2,IL-10,IFN-γ,TNF-α,TGF-β,hHGF)、血液T细胞亚群,观察肝脏病理变化并进行急性排斥反应指数计算。 www.selleck.cn/products/Abiraterone-Acetate-CB7630.html 结果:A组受体大鼠术后MST明显短于B组和C组,B组大鼠术后MST短于C组;HOC和pBLAST2-hHGF/HOC主要定位分布于肝脏的汇管区周围和中央静脉周围,C组肝脏Sry阳性细胞百分率从术后7天开始持续性高于B组;A组大鼠ALT、DBil、GGT、ALP、IL-2、IFN-γ、TNF-α及CD4+/CD8+T细胞比值从术后14天开始明显高于B组和C组,B组上述指标从术后14～21天开始明显高于C组;A组大鼠ALB、XCHE、IL-10及TGF-β从术后14天开始明显低于B组和C组,B组上述指标从术后14～21天开始明显低于C组;从术后14天开始A组肝脏急性排斥反应指数明显高于B组和C组,从术后21天开始B组肝脏急性排斥反应指数高于C组:从术后14天开始A组肝组织CD44、ICAM-1、Fas及CD40免疫组化染色强度和范围大于B组和C组,从术后14～21天开始B组上述指标大于C组。

结论:受体来源pBLAST2-hHGF/HOC在移植肝内的增殖和分化能力较HOC强,主要分布在汇管区周围和中央静脉周围;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC及其分化细胞能够在移植肝内分泌hHGF,可能通过HGF/C-Met途径对移植肝起保护作用,改善受体的肝功能;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC在移植肝内大量增殖、分化和细胞替代后,可以有效地降低移植术后急性排斥反应指数,该方面的作用强于受体来源的HOC;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC和HOC经门静脉和肝动脉输入移植肝后,可以有效诱导受体大鼠对移植肝的免疫低反应性,延长移植术后大鼠的生存期,pBLAST2-hHGF/HOC的作用强于HOC。
吉非替尼是一种靶向抑制表皮生长因子受体(Epidermel Growth Factor Receptor, EGFR)的抗癌药物,为临床上应用的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine 还有 kinase inhibitor,

TKI),可以靶向抑制非小细胞肺癌(non-small lung cancer, NSCLC)表达的EGFR,在治疗NSCLC的临床实践中取得了较满意的疗效。由于吉非替尼对特殊患者的选择性,实际上少部分NSCLC患者对吉非替尼有明显的疗效,大部分患者则无效或疗效差。吉非替尼敏感的患者主要是存在EGFR基因的突变,但EGFR基因突变的患者中不一定都对吉非替尼敏感。这是由于约25%-30%的EGFR基因突变者对吉非替尼原发性或获得性耐药,这种EGFR基因突变型患者对吉非替尼的耐药机制不十分清楚。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种由间质细胞分泌的多功能因子,在体外促进多种细胞增殖和运动。部分肿瘤组织能表达HGF,与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭有关。新近研究显示,肺癌组织中肿瘤编码基因MET扩增与对吉非替尼获得性耐药有关。有报道HGF诱导乳腺癌细胞对抗吉非替尼的生长抑制作用。对吉非替尼耐药的NSCLC细胞的EGFR基因型分两类,分别为EGFR突变型和EGFR野生型。我们选择了不存在EGFRT970M突变或MET扩增或KRAS突变等吉非替尼耐药相关因素,而且对吉非替尼敏感的NSCLC细胞EGFR突变型PC-9和EGFR野生型H292进行了研究。这两株细胞不存在EGFRT970M突变或MET扩增或KRAS突变等吉非替尼耐药相关因素。用HGF诱导这两株细胞,通过检测细胞增殖、周期及凋亡,观察是否对吉非替尼耐药,以及通过免疫印迹检测EGFR蛋白及MET编码的HGF的受体蛋白的表达,研究吉非替尼对非小细胞肺癌耐药的另一个途径的耐药机制,证实HGF/c-Met系统可作为治疗吉非替尼耐药的NSCLC的靶向位点,为临床提供吉非替尼联合c-Met抑制剂或HGF拮抗剂可能有效治疗耐药的NSCLC的理论依据。

Bleomycin MTT法检测PC-9和H292细胞增殖,作图法计算出药物半数抑制浓度(IC50); MTT法检测HGF诱导的PC-9和H292细胞增殖,利用exel文档画出药物浓度-生长曲线；实验分为4组：对照组(O)、肝细胞生长因子组(H)、吉非替尼组(G)、肝细胞生长因子+吉非替尼组(HG)。MTT法检测四组细胞存活率；细胞凋亡试剂盒(Annexin V/PE)染色和细胞周期试剂盒(PI)染色,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期以及最后利用Multicycler 3.0软件分析细胞周期；比色法(Bradford法)为蛋白定量,利用蛋白质免疫印迹(Western bloting)技术检测细胞中c-Met、p-Met、p-EGFR蛋白的表达。 通过上述方法得到如下实验结果： 1、PC-9和H292均为吉非替尼敏感株,IC50分别为0.05±0.01μmol/L和0.17±0.05μmol/L。吉非替尼对PC-9和H292的生长抑制作用呈浓度依赖性,HGF (40ng/ml)诱导的吉非替尼浓度-存活率曲线均往右移,以H292的表现最为明显; 2、HGF(20ng/ml或40ng/ml)没有促进PC-9和H292增殖,但HGF(40ng/ml)和吉非替尼处理组(HG)与单纯吉非替尼处理组(G)相比有更高的存活率(P0.05)。HGF (20ng/ml)能促进PC-9和H292的有丝分裂,但吉非替尼阻滞HGF诱导(HG)的G1期细胞周期比例与单用吉非替尼(G)比较没有差异(P>0.

上皮性卵巢癌患者血清HGF各临床分期之间分别比较,P<0.05,差异有显著性。2.上皮性卵巢癌患者血清HGF各病理分级之间分别比较,P<0.05,差异有显著性。3.HGF和CA125对卵巢癌诊断敏感率分别为90%和60%,而二者联合检测敏感率可达95%,与单独检测相比较,P<0.05,差异有显著性。6.上皮性卵巢癌组织细胞胞浆中HGF各病理分期之间分别比较,P
食管癌是一种高侵袭性的肿瘤，世界范围内，食管癌患者死亡率占肿瘤患者死亡率的第六位，我国是食管癌的高发国家，河南省是高发省份。随着治疗手段的发展，食管癌的预后有所改善，但是其五年生存率仍然不容乐观。浸润转移是引起食管癌患者死亡的主要原因，因此，对食管癌浸润转移机制的探讨已成为研究热点之一。

近来研究发现，在多细胞生物胚胎发育过程中的胚层和组织重建中存在一种现象：上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。最近研究认为它不仅存在于多细胞生物的胚胎发生过程中，同时也存在于多种慢性疾病以及肿瘤的进展过程中。Thiery这样描述上皮性肿瘤发生发展过程中的EMT：正常上皮细胞沿基底膜生长，通过表型遗传学的改变或基因突变，细胞发生转化生成原位癌(此时基底膜仍然保持完整)；继续发展，癌细胞通过EMT形式局部扩散，基底膜变脆，细胞侵入淋巴管和血管，发生转移；在种植部位，癌细胞还可通过间质-上皮转化形成转移瘤。上皮细胞发生EMT，以间质特性获得、上皮细胞极性丧失及运动能力增强为主要特征。这些特点与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移密切相关。目前关于食管鳞癌中是否存在EMT及EMT在食管鳞癌浸润转移中的作用尚未见报道。 以及 EMT是一个极其复杂的过程，包括：(1)细胞间连接(黏附连接、紧密连接、桥粒连接)解体，细胞分散；(2)细胞骨架重排，形成细胞-基质黏附，细胞运动能力增强。(3)细胞基因型的改变：在EMT过程中表达上调的因子主要包括间叶细胞标志物如纤维连接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)、神经钙黏素(N-cadherin)等，以及诱导EMT的细胞因子和转录调节因子，如snail、slug，转化生长因子-β(transforming

growth factor-β，TGF-β)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)；还有对诱导EMT有辅助作用的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。在EMT过程中表达下调的因子主要包括上皮细胞的标志物如上皮钙黏素(E-cadherin)，β-连环素(β-catenin)，γ-连环素(γ-catenin)，细胞角蛋白18(cytokeratin18)等。已有研究发现TGF-β在诱发EMT中起关键作用。 一般 有关食管鳞癌中是否存在EMT以及食管鳞癌中TGF-β1引发的EMT是否与食管癌的浸润转移有关，目前尚未见报道。本研究探讨了食管癌组织及食管鳞癌细胞系EC9706中TGF-β1的表达及其与E-cadherin及Vimentin的关系；采用针对TGF-β1的反义寡核苷酸干扰技术，抑制食管鳞癌细胞EC9706中TGF-β1的转录活性，探讨抑制TGF-β1对E-cadherin及Vimentin表达的影响，观察转染反义寡核苷酸对细胞形态学的影响及对细胞运动能力的影响，从而探讨食管鳞癌细胞中TGF-β1诱导的EMT；并探讨TGF-β1对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响。探讨食管鳞癌浸润转移的分子机制，为食管癌浸润转移的阻断治疗提供理论基础。

材料和方法 1．采用免疫组织化学技术检测了100例手术切除的食管鳞癌组织及其癌旁“正常”粘膜中TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况。 ERK inhibitor 2．采用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术对食管鳞癌细胞系EC9706中的TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白及mRNA表达进行了检测。 3．针对TGF-β1第一启动子的核苷酸片段设计合成反义寡核苷酸(ASODN)，采用阳离子聚合物瞬时转染培养的人食管鳞癌EC9706细胞。 ①观察TGFβ1-ASODN转染后细胞形态学的变化。 ②采用RT-PCR、免疫细胞化学方法、流式细胞术方法观察TGFβ1-ASODN转染后细胞中TGF-β1mRNA及蛋白表达的变化。 ③采用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术方法观察TGFβ1-ASODN转染后细胞中E-cadherine与Vimentin mRNA及蛋白表达的变化。 ④采用细胞划痕试验检测TGFβ1-ASODN转染后细胞迁移能力的变化。 4．采用流式细胞术、MTT观察转染TGFβ1-ASODN后，对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。 5．统计学处理：所有数据均经SPSS13.0软件进行统计分析。计数数据采用阳性率表示，阳性率之间的比较采用χ~2检验(Chi-square)，阳性率间相关性采用Kendall相关进行比较；计量数据采用(?)±S表示，两组均数的比较用t检验(t-test)，两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)。显著性水平α=0.05。 结果 1．TGF-β1蛋白在食管鳞癌中的表达(85.0％)明显高于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(27.0％)(P＜0.01)，其在深层浸润组中的表达(90.6％)高于其在浅层浸润组中的表达(75.0％)(P＜0.05)。 2．E-cadherin蛋白在食管鳞癌中的表达(43％)明显低于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(85％)(P＜0.01)；Vimentin蛋白在食管鳞癌中的表达(23％)高于其在癌旁“正常”粘膜中的表达(0％)(P＜0.05)。 3．在食管鳞癌组织中，TGF-β1的表达与E-cadherin的表达呈负相关关系(T_b=-0.257，P＜0.05)；TGF-β1的表达与Vimentin的表达呈正相关关系(T_b=0.163，P＜0.05)；Vimentin的表达与E-cadherin的表达呈负相关关系(T_b=-0.379，P＜0.

05），S期细胞数量与对照组相比则增多，与对照组相比较差异具有统计学意义（P
目的：探讨以磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶蛋白家族成员雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）为中心的信号通路，在克唑替尼（Crizotinib）诱导的EML4-ALK （Echinoderm microtubule-associatedprotein-like4，棘皮动物微管结合蛋白4，Anaplastic lymphoma kinase，间变性淋巴瘤激酶)融合基因阳性的非小细胞肺癌细胞株H2228凋亡中的作用。方法：根据不同的实验目的处理H2228细胞后，采用荧光定量PCR检测基因状态，噻唑蓝(MTT)法检测细胞抑制率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期；采用Western blotting检测细胞mTOR信号通路中的关键蛋白表达及活化水平。 结果：crizotinib对H2228细胞有促凋亡作用，且呈时间和剂量依赖性，且能使H2228细胞阻滞在G1期。在使用crizotinib处理的凋亡细胞株中发现mTOR活化水平降低，mTOR的上下游关键蛋白活化水平都呈下降趋势，肺癌细胞株H2228中的特殊表达的融合蛋白EML4-ALK V3表达量未受影响，但其活化形式p-ALK明显受到抑制。结论：初步证实mTOR信号通路在crizotinib诱导含有EML4-ALK融合基因的肺癌细胞H2228凋亡中有一定关系，为crizotinib的作用机制提供了一个依据。
目的:探讨HERG钾离子通道特异性抑制剂E-4031对多种白血病细胞VEGF分泌和迁移的影响。 方法:(1)使用ELISA检测多种原代白血病细胞在HERG钾离子通道抑制剂E-4031处理前后的VEGF分泌,实验重复3次。(2)使用Transwell实验方法检测白血病细胞系K562、白血病干细胞和多种原代白血病细胞在经E-4031处理前后的迁移,实验重复4次。

结果:(1)用E-4031处理原代白血病细胞后其VEGF分泌量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。E-4031对VEGF分泌影响在M2最显著,药物处理后VEGF的分泌量降低了94.86%,其次为B-ALL(93.38%)和M4(93.0%),CML(47.76%)降低最不明显。(2)E-4031对白血病细胞和白血病干细胞的迁移行为有显著阻碍作用,差异具有统计学意义(P
目的研究构建人鼻咽癌细胞系HNE1细胞培养体系及鼻咽癌动物模型，为开发提供物质基础。研究鼻咽癌热疗后在体内HSP70/HSP90的表达规律及其抑制对热疗疗效的影响机制，为协同治疗提供理论基础。研究体内应用HSP70/HSP90抑制剂后，热疗治疗鼻咽癌的实验性和有效性，为降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。 Selleck PLX3397 Alectinib 方法裸鼠鼻咽癌转移瘤模型的制备：人鼻咽癌细胞系HNE1细胞体外培育后细胞悬液背部皮下注射。确认肿瘤细胞生长直径为6 mm左右裸鼠按体重随机分为六组：未处理组9只，高热组9只，热疗加格尔德霉素组11只，热疗加槲皮素组11只，格尔德霉素加槲皮素组11只，以及热疗加格尔德霉素加槲皮素组11只。热疗及用药：根据裸鼠体重，用槲皮素（Quercetin）或格尔德霉素给药及联合给药，对照组给予等量生理盐水。热疗方案：将小鼠右后腿固定于一钢条上，加重固定，保持瘤体浸入43度热水中,右后腿浸泡时间为2小时。热疗和治疗疗程结束后，分组处死全部裸鼠，取出肿瘤称重。荧光法检测肿瘤组织内的凋亡率，按照ECL化学发光试剂盒说明书操作，照相，应用spss17.0进行统计学分析。结果共62只裸鼠，肿瘤相对均匀，直径约5-6mm大小，处理前瘤体体积比较：应用Spss17.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较得p>0.05，组间没有显著差异。热疗处理后瘤体体积比较：组间比较p<0.05，组间存在显著性差异。凋亡率的比较：经单因素方差分析检验p0.05。凋亡率的比较显示两组间凋亡率的p>0.05。根据统计分析得出结果为两组没有显著差异。对照组（未处理组）与其他处理组比较p<0.05，有明显统计学差异。组间比较热疗加槲皮素加格尔德霉素组与其他组比较，所得p
Hsp90抑制剂(Hsp

Inhibitors)为目前一类新型的抗癌药物。它以Hsp90这种热休克蛋白为靶点,通过抑制Hsp90的伴侣分子作用,从而抑制癌症的发生和发展过程。由于它是以一类特殊的蛋白为靶点,打破了之前以基因为靶点研究癌症药的固定思路,具有新颖性,前瞻性,并且可以与其他类别的抗癌药联合使用。 芳香吲唑酮类化合物为新型的Hsp90抑制剂。世界著名药物研发公司Senerex所研发的SNX-2122,SNX-5422也是一类芳香吲唑酮类结构,并且这两种药物已经进入临床测试。国内外的文献研究表明,芳香吲唑酮类化合物的结构具有多种生理活性,在癌症方面的活性具有广泛的应用前景。在此基础上,为了寻找一种高效低毒的Hsp90抑制剂,本研究以国外的文献为基础,合成了11种芳香吲唑酮类化合物作为先导物,并在此基础上得到所设计的3个目标产物,通过1H Screening Library NMR和MS进行结构确证,并且有选择地做了活性检测和工艺放大研究。结果发现,我们以芳香吲唑酮作为母核结构所设计的分子具有一定的活性,其中,化合物AX1319(最终合成的芳香吲唑酮类化合物)对Hsp90a表现出较好的抑制活性。工艺优化的实验表明,在无水乙醇溶液中,与2e.q.(e.q.=equivalent)乙醇钠在120摄氏度反应16h时目标产物的产率最高。 本文内容主要分为以下几个部分： 一芳香吲唑酮类化合物的合成 1选择两条路线合成芳香吲唑酮类化合物： 1.1采取以不同衍生化的5,5-二甲基-1,3-环己二酮与4-取代苯基肼在酸性条件下发生环合反应得到三种芳香吲唑酮类化合物。方法：4-取代芳香胺在酸性条件下与亚硝酸钠在冰浴中得到4-取代芳基重氮盐,重氮盐反应液在NaHSO3和NaOH碱性溶液的作用下还原,生成4-取代苯肼盐酸盐。得到的芳基肼盐酸盐与不同衍生化的5,5-二甲基-1,3-环己二酮在酸性条件下发生环合反应,得到最终化合物4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑-1-基)苯甲酸,4-(3-乙氧羰基-6,6-二甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑-1-基)苯甲酸,4-(6,6-二甲基-4-氧-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢吲唑-1-基)苯甲酸。结构经1HNMR, MS确证。 1.2采取5,5-二甲基-1,3-环己二酮与亚联氨基(肼叉)氯在碱性条件下合成芳香吲唑酮类化合物。方法：4-取代芳香胺在酸性条件下与亚硝酸钠在冰浴中得到4-取代芳香重氮盐,调节pH至5后滴加2-氯乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液,得到4-取代肼叉氯化合物。乙醇重结晶后在碱性条件下与5,5-二甲基-1,3-环己二酮发生亲核取代、脱水反应后,经过柱层析得到9个最终产物：4-(3-乙氧羰基-6,6-.

05)；雷帕霉素使细胞周期阻滞在G1期,17-AAG亦使细胞周期阻滞在G1期,尤其是作用48h时周期阻滞明显(P<0.0001)；单用雷帕霉素或17-AAG时均可降低蛋白AKT的表达并在一定程度上诱导细胞凋亡(P<0.0001)；联合使用雷帕霉素与17-AAG时可显著降解AKT,明显诱导细胞凋亡,凋亡率明显高于任一单药(P
目的 海绵来源化合物BA是一个具有全新化学骨架结构的抗肿瘤先导化合物,但是其体内外抗肝癌生物学效应及作用机制尚不明确。本研究以人肝癌细胞和裸鼠肝癌移植瘤模型为研究对象,分析海绵来源化合物BA抑制细胞增殖、迁移、诱导细胞凋亡及其作用机制,并探讨BA在裸鼠肝癌模型中的抗肝癌效应及其作用机制。 购买MLN2238 方法 1、体外研究：①BA抑制细胞增殖的效应：MTT比色法检测BA对人肝癌细胞SMMC-7721、Huh-7和HepG2,正常肝细胞L02增殖的影响；②BA抑制细胞迁移的效应：Transwell法检测BA对SMMC-7721细胞的迁移能力；③BA诱导细胞凋亡的效应：H&E染色法鉴定BA诱导SMMC-7721细胞凋亡形态的变化,荧光倒置显微镜与流式细胞术Annexin

V-FITC/PI法分析BA诱导SMMC-7721细胞凋亡作用；Western Blot法检测凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表达变化；④BA抑制细胞增殖、迁移并诱导凋亡的作用机制：Western Blot法检测BA及BA联用LY294002或IGF-1对SMMC-7721细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化。 2、体内研究：①裸鼠肝癌模型的建立：采用1.0×108/m1肝癌SMMC-7721细胞悬液,于裸鼠右腋皮下接种0.1ml,建立肝癌裸鼠模型；②药物干预：裸鼠肿瘤生长至100-150mm3左右,将裸鼠分为4组,以空白溶媒组、5mg/kg和10mg/kg化合物BA组以及10mg/kg5-FU组连续5天腹腔注射给药；③检测指标：监测裸鼠肿瘤大小,计算抑瘤率,评价化合物BA体内抑制肝癌效应；记录裸鼠的体重,研究BA对裸鼠生存质量的影响；眼球取血检测裸鼠肝肾功能；取肿瘤组织以及裸鼠各脏器组织,H&E染色观察肝癌和脏器组织形态变化；④BA体内抗肝癌的作用机制：采用免疫组化和Western

通常 Blot法分析BA对肿瘤组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响。 结果 1、化合物BA的体外抗肝癌效应 ①BA抑制细胞增殖的效应：BA能够抑制系列肝癌细胞株与正常肝细胞L02的增殖,且抑制SMMC-7721细胞增殖呈浓度与时间依赖性关系(p<0.05)。②BA抑制细胞迁移的效应：经BA处理的SMMC-7721细胞的迁移数低于未经BA处理的SMMC-7721细胞组(P<0.05)；呈浓度依赖性关系下调凋亡蛋白Caspase9表达水平(p0.05)；BA联合LY294002或IGF-1对PI3K/AKT信号通路中蛋白表达的作用：在SMMC-7721细胞中,BA联合LY294002组与单用BA和LY294002组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降更显著(p<0.05)；BA联合IGF-1组与单用IGF-1组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降(p
研究目的：探索PcG 很少 (Polycomb Group)家族蛋白的成员之一色素框同源蛋白7(Chromobox Protein Homolog7,CBX7)对胃癌干细胞自我更新能力、克隆增殖能力等干细胞相关特性的调节作用,并探索CBX7调控胃癌干细胞样特性的作用机制。 研究方法：采用无血清悬浮培养的方法从胃癌细胞系中分离出胃癌干细胞样亚群,Western blot检测胃癌干细胞样亚群与贴壁细胞比较干细胞相关因子Oct4.

CD44. CD24及PcG家族蛋白CBX7表达的差异。基因转染下调胃癌细胞中CBX7表达,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot检测基因下调效果,无血清悬浮培养、平板克隆等检测CBX7表达下调后胃癌干细胞样特性的变化。Western blot检测CBX7下调后下游已知靶基因p16、E-cadherin和可能靶基因pAkt、pERK表达变化,RT-PCR检测CBX7下调后miR-21表达改变。同时Western blot检测胃癌悬浮干细胞球与贴壁细胞比较CBX7下游已知靶基因p16及可能靶基因pERK, pAkt表达的差异,RT-PCR检测miR-21表达的差异。在胃癌细胞中下调p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。采用共转染的方法,在胃癌细胞中同时干扰CBX7和p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。 主要结果： 1.MKN28. SGC-7901、NCI-N87胃癌细胞系能在无血清悬浮培养条件下产生干细胞球,而MKN45、HGC-27胃癌细胞系在无血清悬浮培养条件下不能形成干细胞球。MKN28、SGC-7901胃癌悬浮干细胞球较贴壁细胞明显高表达CBX7和干细胞相关因子Oct4, MKN28胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD24,不表达CD44,而SGC-7901胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD44, CD24表达无明显差异。 2.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,胃癌细胞悬浮培养成球率下降,克隆形成率降低。 3.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,SGC-7901细胞中p16、E-cadherin表达上升,且pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变,miR-21则表达下降。MKN28、AGS细胞中pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变。 4. MKN28、SGC-7901胃癌干细胞球与贴壁细胞比较,pAkt表达无明显差异,pERK表达略有下降,SGC-7901胃癌干细胞球低表达p16, western blot未检测到MKN28细胞p16表达,MKN28胃癌干细胞球较贴壁细胞比较miR-21表达无明显变化。 5. ATM/p53在MKN28胃癌干细胞球中表达降低,而在SGC-7901胃癌干细胞球中无明显改变。 6.

3g,30Hz,30min/day),培养14天后,茜素红染色观察矿化结节形成情况。 Ⅱ.环氧合酶(COX-2)在LMHFV影响成骨细胞生物学特性中的作用 1. LMHFV对成骨细胞COX-2 mRNA及蛋白表达的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz). LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min)。分别于LMHFV干预结束后0、0.5、1.5、3、6h-①提取细胞总RNA, 而且 qPCR法检测COX-2 mRNA表达,以GAPDH为内对照,分析COX-2 mRNA相对表达的变化；②提取细胞总蛋白,Western

blot检测COX-2蛋白表达,以β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。 2. LMHFV对成骨细胞表达PGE2活性的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min)。分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；在COX-2特异性抑制剂NS-398抑制实验中,MC3T3-E1细胞先与10μM NS-398孵育1h,再施加LMHFV刺激,在LMHFV干预结束后0.5h分别收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；ELISA法检测细胞培养上清液中PGE2活性,并以细胞总蛋白量标准化,分析PGE2活性相对表达的变化。 3。COX-2特异性抑制剂NS-398对LMHFV增加成骨细胞OPG分泌的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control (OHz)+VEHICLE组、Control (OHz) +NS-398组、LMHFV (30Hz)+VEHICLE组、LMHFV (30Hz)+NS-398组。VEHICLE为溶解NS-398的等量DMSO, MC3T3-E1细胞先与10μMNS-398孵育1h,再施加LMHFV

(0.3g,30Hz,30min)刺激,在LMHFV干预结束后6h分别收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；ELISA法检测细胞培养上清液中可溶性OPG活性,并以细胞总蛋白量标准化,分析OPG分泌的变化。 4。COX-2特异性抑制剂NS-398对LMHFV诱导成骨细胞分化作用的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control (OHz)+VEHICLE组、Control (OHz)+NS-398组、LMHFV (30Hz)+VEHICLE组、LMHFV (30Hz)+NS-398组。干预方法为：对细胞施加8天的LMHFV (0.3g,30Hz,30min/day)刺激,VEHICLE为溶解NS-398的等量DMSO,细胞与10μM NS-398孵育8天,干预结束后,分别收集细胞、提取细胞总蛋白；按前述方法分别检测ALP活性、OCN表达,并以细胞总蛋白量标准化,分析ALP活性、OCN表达相对改变的变化。 Ⅲ. LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的信号转导机制 1. LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的信号转导途径初探 分别于MC3T3-E1细胞施加LMHFV (0.3g,30Hz,30min)刺激前1h加入各种信号通路抑制剂NS-398、Staurosporine、H-89、U0126、SP600125、SB203580,于LMHFV加载结束后3小时,提取细胞总蛋白。Western Trichostatin A半抑制浓度 blot检测COX-2蛋白表达,以β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。 2. cAMP/PKA信号通路对LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的影响 (1) LMHFV对成骨细胞PKA信号通路的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz)、LMHFV组(30Hz), CAL-101溶解度 Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min),分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞,提取细胞总蛋白。Western blot检测PKA总蛋白及磷酸化蛋白含量,以总蛋白为对照,分析PKA磷酸化蛋白含量相对值的变化。 (2)

LMHFV对成骨细胞内cAMP水平的影响 MC3T3-E1细胞随机分为Control组(0Hz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min),分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞。cAMP ELISA试剂盒检测LMHFV对成骨细胞内cAMP水平的影响。 (3) LMHFV加载成骨细胞含PGE2条件培养基(Conditioned medium,CMPEG2)对成骨细胞内cAMP水平的影响： LMHFV加载MC3T3-E1细胞结束后0.5h,分别收集0Hz、30Hz组含PGE2的条件培养基(CMPGE2),随机将MC3T3-E1细胞分为CM0Hz组、CM30Hz组,与相应的CMPGE2分别共孵育0、0.5、1.5、3、6h后收集细胞,cAMP ELISA检测试剂盒检测CMPGE2对成骨细胞内cAMP水平的影响。 (4)腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin, FSK)对成骨细胞内cAMP水平的影响： MC3T3-E1细胞与15μM FSK分别共孵育0、0.5、1.5、3、6h或分别与0、5、10、15、20μM FSK共孵育3h后,按cAMP ELISA检测试剂盒要求收集细胞,检测含FSK对成骨细胞内cAMP水平的影响。 (5)PKA抑制剂对LMHFV、FSK、CMPGE2诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的影响 在MC3T3-E1细胞接受各种干预因素前加入30μM H-89孵育1h,分别于LMHFV (0.3g、30Hz、30min)加载细胞后3h、15μM FSK刺激细胞后3h、CMPGE2孵育细胞后3h,收集细胞,提取总蛋白。Western blot检测COX-2蛋白表达情况,β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。 结果 Ⅰ。低强度高频率振动(LMHFV)影响成骨细胞生物学特性的作用 1. LMHFV影响成骨细胞OPG/RANKL比率的作用 (1) LMHFV对成骨细胞表达OPG/RANKL比率的影响： LMHFV加载结束后6h,与0Hz相比,30Hz LMHFV能明显促进成骨细胞分泌OPG(P<0.