05)：Skp2在高、中、低分化鳞癌中的阳性表达率为30.30％、60％、75％，差异有显著性(P＜0.05)；Skp2在淋巴结转移组的阳性率为72.73％，在无淋巴结转移的喉癌中的阳性表达率为25.71％，两组有显著性差异(P＜0.05)；Skp2在Ⅰ～Ⅱ期LSCC中的阳性表达率为29.63％，在Ⅲ～Ⅳ期LSCC中的阳性表达率为56.67％，两组间有显著性差异(P＜0.05)；Skp2的表达在不同年龄组、肿瘤大小间无统计学差异(P＞0.05)。 或者 4．应用Spearman等级统计分析，喉癌中c-met的异常表达与β-catenin的异常表达呈正相关(r_s=0.367，P＜0.05)；c-met的异常表达与Skp2的异常表达呈正相关(r_s=0.354，P＜0.05)；β-catenin的异常表达与Skp2的异常表达呈正相关(r_s=0.426，P＜0.05)。 结论： 1．c-met在LSCC中的表达高于正常粘膜和息肉且与LSCC的组织分化程度、淋巴结转移、临床分期有关，提示c-met在LSCC的发生、发展和淋巴结转移中起重要作用，c-met可以作为预后评估的预测因子。抑制c-met表达可能作为抗肿瘤侵袭和转移治疗的策略之一。 2．β-catenin在正常粘膜和息肉中胞膜阳性表达，在LSCC中主要表现为胞膜表达减少和异位表达，β-catenin在喉癌中的表达与组织分化程度、淋巴结转移有关，提示了β-catenin介导的细胞粘附的减弱或丧失，及Wnt信号的异常激活，在LSCC的发生、分化不良及淋巴结转移中起到重要作用。β-catenin的异常表达可能是喉癌发生的早期事件。

3．Skp2在LSCC中的表达率高于正常粘膜和息肉且与组织分化程度、淋巴结转移、临床分期有关。提示Skp2蛋白与LSCC的发生发展有关，并可能是反映肿瘤细胞增殖的标志物和新的肿瘤基因治疗靶点。 4．在LSCC中，c-met表达、Skp2表达和β-catenin的异常表达之间密切相关，提示三者在喉癌的发生发展和转移中可能有协同作用。
上世纪80年代,met作为原癌基因被首次发现。其表达产物c-Met是一类酪氨酸激酶受体,唯一的配体是肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)。c-Met在大多数实体肿瘤以及白血病均明显高表达,且与肿瘤临床预后不良高度相关。HGF/SF、c-Met在肿瘤的发生发展、转移过程中起关键作用,可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和肿瘤血管生成。c-Met也因此成为抗肿瘤治疗的重要靶点。目前已开展的针对HGF/SF和c-Met的肿瘤治疗包括,反义核酸分子、小分子RNA、HGF/SF拮抗剂NK4、c-Met抑制剂SU11274等,以及抗c-Met或抗HGF/SF的抗体等。

抗体由于其对相应靶抗原具有高度的特异性并能偶联其它抗肿瘤药物结合到靶抗原分子而成为抗肿瘤药物研发的热点。在临床治疗中,人抗鼠抗体反应(HAMA)等缺点影响了鼠源性单抗的应用,因此研制全人源抗体成为重要的发展方向。噬菌体抗体库技术是制备全人源抗体的主要技术平台。大容量、具有良好多样性的抗体库,是获得各种人源抗体的有效途径,而且对获得高亲和力抗体以及在对抗体性能进行改造方面具有较强的优势。本文应用噬菌体抗体库技术,克隆出全套人抗体基因,并在噬菌体表面表达,构建大容量人源天然Fab抗体库,从中筛选出特异性抗c-Met全人源Fab抗体片段,为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。 研究方法 1.取20位健康成人骨髓分离后的淋巴细胞,抽提总RNA,反转录成cDNA。以25对人源抗体基因引物扩增抗体可变区基因;从两个重组载体pComb 3XTT和pComb 3Xλ中将重链CH_1、轻链恒定区CL基因分别扩出。再经2轮Overlap-PCR连接得到Fab基因。Fab基因和pComb3XSS载体各经SfiⅠ酶切后,进行二者连接。通过多次电转化导入E.coli.XL1-Blue菌,得到人源天然Fab噬菌体抗体库。 时间 2.以固相化蛋白对抗体库进行6轮筛选,随机挑选60个克隆用Phage ELISA进行鉴定。阳性者经BstOI酶切片段分析为不同克隆的,行测序分析,并转化入E.coli.TOP10F’中进行可溶性表达。用Western-blot分析上清和沉淀中的Fab表达情况,ELISA鉴定其特异性。 研究结果 1.用12对重链基因引物、4对κ链基因引物和9对λ链基因引物扩增出全部抗体可变区基因,再经2轮Overlap-PCR后得到Fab基因片段。经过一百次电转化,获得了库容为1.2×10~9的人源天然Fab噬菌体抗体库。 2.抗体库经过6轮筛选后,噬菌体抗体收获率较第1轮提高5.8×10~3倍,得到了明显富集。随机挑选60个克隆经Phage

ELISA鉴定,4个克隆为阳性。BstOI酶切片段分析它们为同一克隆,命名为AM2-26。测序结果显示为人免疫球蛋白可变区基因。可溶性表达后的上清经western-blot分析证实在相对分子量26kD和30kD左右有二条阳性条带。ELISA鉴定表明AM2-26是与c-Met有特异性结合活性的Fab抗体片段。 结论 1.成功构建了库容1.2×10~9的大容量人源天然Fab噬菌体抗体库。 2.从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,与c-Met有特异性结合活性,为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。
c-Met是由原癌基因Met编码的酪氨酸激酶受体,位于细胞膜上,包含1个50kDa的α亚基和1个150kDa的β亚基,两者经二硫键连接形成异二聚体。c-Met是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor/scatterfactor,HGF/SF)在体内的唯一受体,两者结合并随之激活后可促进肿瘤细胞的增殖、迁徙和新血管生成,最终导致恶性肿瘤的侵袭和转移。目前HGF/SF和c-Met多种拮抗剂的研究已在体外和动物实验中证明可有效地抑制肿瘤的发生、侵袭和转移,HGF/SF-c-Met已经成为肿瘤诊断和生物治疗的新靶点。鼠源抗HGF/SF和c-Met单克隆抗体和/或多克隆抗体已在体外和动物实验中显示出高亲和力和中和活性,但是鼠源性单克隆抗体引起的人抗鼠抗体反应(human 可能 antimouse antibody,HAMA)限制了鼠源抗体在临床中的应用。这就推动了人源化单克隆抗体的研究。与鼠源性单克隆抗体相比,人源化单克隆抗体免疫源性明显减弱,并且血清半衰期显著延长,促进了单克隆抗体在临床中的应用。本文利用固相筛选方法从大容量人源天然Fab抗体库中筛选抗c-Met Fab抗体,并对其与人肝癌细胞的结合活性进行鉴定,为研制用于肝癌生物治疗的靶向药物,提供候选分子。 材料与方法 1.以Met-Fc融合蛋白包板,扩增本实验室制备的大容量人源天然Fab抗体库(库容为1.2×10~9)。将噬菌体抗体加入Met-Fc包被的ELISA板,进行6轮洗脱、富集,从第6轮筛选后得到的细菌集落中随机挑取60个克隆,分别用Met-Fc、IgG包板,用Phage ELISA方法鉴定它们的免疫学特性。 2.

05);B组进一步分化为神经元的阳性率明显高于A、C组,差异有统计学意义(P0.05);半定量RT-PCR观察B组神经干细胞p38αmRNA表达明显高于A、C 2组;MTT法检测与半定量RT-PCR结果相似。结论人胚胎干细胞体外分化过程中,血管内皮生长因子促进神经干细胞分化的作用与p38MAPK通路无关,而VEGF通过激活p38MAPK信号通路,促进神经干细胞进一部分化为神经元。
目的探讨c-Jun氨基末端激酶通路(JNK)和p38通路在癫痫持续状态(SE)大鼠海马中的活性变化规律及其意义。方法建立氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型,在不同时间点用免疫组化法检测海马结构JNK和p38磷酸化状态,并观察组织病理学改变。结果对照组P-JNK极少活化而p38在海马各结构广泛活化。SE 30 min后JNK和p38在海马神经元强烈激活,2 h时达到高峰,6 h后各区均明显减少,12 h后降至基础水平,在所有时间点,JNK和p38在齿状回的活化程度均显著高于CA1和CA3区。海马结构各区可见到许多神经元发生变性和坏死。结论 JNK和p38信号转导通路在氯化锂-匹罗卡品致痫过程中被激活,并可能在发作后参与海马神经元损伤的病理生理过程。
全反式维甲酸(all-trans

retinoic acid,ATRA)诱导细胞分化与上调转录因子Krüppel样因子4(KLF4)表达有关,但目前对ATRA诱导KLF4表达的分子机制尚不清楚.为了研究ATRA在血管平滑肌细胞(VSMC)中诱导KLF4表达的分子机制,本研究观察ATRA对视黄酸受体α(retinoicacid receptorα,RARα)和KLF4表达的影响及RARα介导ATRA诱导KLF4表达所依赖的信号转导途径.实验结果显示,ATRA可显著诱导RARα和KLF4表达,用RARα拮抗剂Ro 41-5253阻断ATRA与受体相互作用后,ATRA诱导的KLF4表达受到显著抑制.用p38 phosphatase 抑制剂 library MAPK、ERK和Akt抑制剂阻断ATRA与RARα相互作用所激活的信号转导途径后,发现阻断p38 已经 MAPK信号途径显著抑制ATRA诱导的KLF4表达,抑制ERK信号途径使ATRA对KLF4表达的诱导作用明显增强,抑制Akt信号途径不影响KLF4基因表达.表明RARα介导ATRA对KLF4表达的诱导作用,ATRA通过抑制ERK和激活p38

MAPK信号途径发挥其对KLF4基因表达的诱导作用.
~~
目的:探究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)中药源抑制剂的抗炎机制。方法:iNOS在辅助因子存在情况下,将L-精氨酸转变为L-瓜氨酸的同时产生一氧化氮(NO),过量的NO将导致细胞损伤、组织坏死,进而促进炎症性疾病的发生和发展。结果:iNOS的表达与信号通路中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、核因子(NF)-κB通路、蛋白激酶(PK)C通路、环腺苷酸(cAMP)依赖PKA通路、核激素受体过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)通路、磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)通路、JAK/信号转导及转录活化因子(STAT)通路、血红素加氧酶(HO)-1/一氧化碳(CO)通路均密切相关。结论:iNOS中药源抑制剂通过各种信号通路而发挥其抗炎作用。
研究显示黄连素具有调节机体糖脂代谢的活性。该文从胰岛素分泌和胰岛素信号通路作用、葡萄糖转运及代谢、低密度脂蛋白受体、AMP激酶活性、脂肪细胞分化及脂质代谢和能量代谢等方面探讨黄连素调节糖脂代谢及其联合调节的作用机制,并就其提示的临床应用前景及面临问题进行了综述。
内皮细胞激活是内皮细胞损伤的始动因素,是引起各种不同程度的炎症反应和细胞凋亡的前提条件 为什么 ;丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 是哺乳动物细胞中重要的信号转导通路,其中 p38MAPK 通路在细胞应激、细胞生长、凋亡和炎症等多种生理和病理过程中起重要作用,越来越引起业界的广泛关注,本文就 p38MAPK 信号通路及其与内皮细胞激活的相关性做一综述,旨在进一步对内皮细胞损伤引发心血管疾病研究提供参考资料。
疼痛是一种与组织损伤或潜在损伤相关的不愉快的主观感觉和情绪体验。病理性疼痛包括炎症性疼痛和神经病理性疼痛,是神经元可塑性变化的表现形式之一[1]。外周和中枢的敏感化是疼痛产生的病理基础,细胞内信号转导通路的激活和细胞的可塑性
阿尔茨海默病(Alzheimer’s

disease,AD)是老年痴呆最常见病因。临床以老年斑(senile plaques,SP)和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)为特征,其病理变化以细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积导致SP的形成及细胞内自我聚集的高度磷酸
目的:研究通窍止咳液增强顺铂对肿瘤细胞内p38的活性。方法:通过Western-Blot检测通窍止咳液对人鼻咽癌细胞CNE2、人肺癌细胞A549内p38活性的变化;通过MTT比色法检测通窍止咳液单用以及联合顺铂对CNE2、A549细胞生长的影响。结果:Western-Blot检测结果显示,通窍止咳液能够激活CNE2和A549细胞内p38,增高细胞内p38的磷酸化水平;MTT检测结果显示高浓度的通窍止咳液可以抑制CNE2、A549细胞的生长,通窍止咳液能增强顺铂对CNE2细胞的细胞毒作用,而对A549细胞则无此作用。结论:通窍止咳液增强顺铂的细胞毒作用可能与其激活p38有关,这一作用为逆转顺铂耐药提供了新的治疗方案。
AIM: To evaluate the efficacy and the safety of azathioprine (AZA) and buthionine sulfoximine (BSO) bylocalized application into HepG2 tumor in vivo.

NEO(MT2)、3′-OH-T-2毒素(MT3)和3′-OH-HT-2毒素(MT4)。大鼠肝微粒体中除发现上述4种代谢物外,还检测到T-2triol,证明大鼠肝脏代谢T-2毒素能力强于其他动物。与陆地动物显著不同,水生动物鲤肝微粒体中只检测到HT-2毒素、NEO、3′-OH-T-2毒素和微量3′-OH-HT-2毒素代谢物。草鱼中检测到3’-OH-T-2和3′-OH-HT-2毒素,但并未检测到HT-2毒素。3’-OH-T-2毒素和NEO是鱼类的主要代谢产物。陆地动物(猪、鸡和大鼠)生成HT-2毒素的相对含量比鱼类显著高p<0.05),但3’-OH-T-2的含量比鱼类显著低(p<0.05)。STAT3mRNA表达活性也受到显著抑制(p<0.05),但STAT1mRNA并未出现显著抑制效应。T-2毒素诱导IL-6基因表达在12h出现了显著的抑制p
背景：人参皂苷Rh2是中国传统中药人参中的主要活性成分，具有优异的免疫调节、抗炎、抗疲劳、抗肿瘤等药理作用。然而因其难溶于水,限制了体外实验中可应用的最大浓度，人参皂苷Rh2的生物活性在实际应用和生产研究中受到严重的制约。为了提高Rh2的水溶性和生物活性，本室制备了人参皂苷Rh2的硫酸化修饰产物Rh2-B1和Rh2-B2。两种衍生物的水溶性都获得大幅提高。在本论文中，我们研究了Rh2-B1对细胞毒性T细胞系CTLL-2细胞的作用，细胞毒性T细胞因其能够保护机体免受病毒感染而成为近年来研究的热点，此外，我们还探讨了Rh2影响CTLL-2细胞增殖和发挥免疫功能的分子机制。

Fludarabine 目标：我们的目标是调查Rh2-B1对干扰素-（γInterferon-γ, IFN-γ）的分泌和细胞增殖的影响，并研究其可能的机制。

材料与方法：酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA）被用于检测IFN-γ在全血培养上清和CTLL-2细胞培养上清液中的浓度。噻唑蓝染色法（MTT Cell Proliferation http://www.selleckchem.cn/products/MLN8237.html Assay，MTT）被用来检测CTLL-2细胞的增殖情况。蛋白免疫印迹试验（Western blot）被用来评价CTLL-2细胞中信号转导通路相关蛋白表达量及其活化程度的变化。 结果：我们的研究证明，Rh2-B1能够显著提高Balb/c小鼠全血培养上清中IFN-γ的水平。在此之后，我们评估了Rh2-B1对CTLL-2这种细胞毒性T细胞的增殖、IFN-γ的分泌情况的影响，并研究了其作用机制。Rh2-B1刺激了CTLL-2细胞的增殖和IFN-γ的分泌，还能够介导丝裂原活化蛋白激酶p38（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）和胞外信号调节激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）的表达和活化，但对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck or p56Lck）和信号转导及转录激活因子（Signal transducers and activators oftranscription5，STAT5）的表达呈现抑制作用。这种作用能够被特异性的p38MAPK抑制剂SB203580和特异性ERK抑制剂U0126阻断。 结论：Rh2-B1能够通过激活p38MAPK和ERK依赖的信号通路进而刺激细胞毒性T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。这可能成为一种新的病毒感染治疗潜在药物。
凋亡对于胚胎发育具有至关重要的作用，细胞增殖和凋亡的共同作用才雕塑出了面部复杂精细的结构。各种原因导致的凋亡改变，会干扰两侧腭突和原始腭的融合，从而引起腭裂的发生。研究证明骨形成蛋白（bone

morphogenetic protein (BMP))通过调节凋亡，能够导致上颌骨和腭骨的缺损，进而引起腭裂的发生；而其上游基因GATA-6作为与胚胎发育密切相关的转录调节因子，能引起多个胚层来源的器官发育异常。GATA-6等位基因完全被敲除的杂合子动物无法存活，而胚胎干细胞小体（embryonic stem cell–derived embryoid bodies (EBs))能够准确模拟胚胎发育早期的情况，因此是研究GATA-6与腭裂等胚胎发育异常导致的先天性畸形相关性的理想模型。 GATA蛋白家族，作为一组锌指翻译因子，对于细胞分化和胚胎器官发育具有非常重要的作用。在小鼠体内敲除GATA-6会阻碍内胚层的分化，并且引起外胚层的凋亡。之前的实验观察到，敲除GATA-6的EB内出现大量的凋亡，并且其内胚层的分化会受到影响。本实验发现，将正常的内胚层细胞的移植到突变的胚胎干细胞小体能够完全阻止细胞凋亡，并恢复外胚层极化和成腔。laminin能够诱导基底膜细胞在突变胚胎干细胞小体上组装；而laminin γ1被敲除的内胚层细胞移植到突变胚胎干细胞小体上，由于不分泌三聚体层粘连蛋白，就不会形成基底膜，只能部分抑制凋亡。这些现象说明内胚层细胞来源的基底膜和非基底膜因素都对于GATA-6依赖的细胞存活具有重要的作用。 有 我们的微阵列分析显示在EB分化的过程中，BMP-2、IGF-2、TGF-β和VEGF-A的表达增加，而BMP-4，FGF-4，PDGF-A，PDGF-C和VEGF-C的表达减少。为了确定这些生长因子的表达在GATA-6被敲除的胚胎干细胞内是否发生了改变，我们采用了逆转录PCR（RT-PCR）和免疫印迹的方法对2天的EB进行分析，发现GATA-6被敲除后，BMP-4和IGF-2的mRNA表达明显减少，而FGF-4的mRNA表达不变。重要的是，BMP-2的mRNA在2天正常的EB内已经能检测到，然而在GATA-6被敲除的EB内则检测不到。为了证明各种生长因子对EB凋亡的影响，我们在1天的GATA-6-/-的EB内，使用分别使用浓度为0.1μg/ml的BMP-2, FGF-4, EGF, IGF-2,PDGF和TGF-β1分别作用24小时，并且与对照组相比，然后使用全量免疫染色，通过检测cleaved caspase-3对凋亡进行分析。结果显示凋亡广泛的出现在GATA-6-/-的EB的周围细胞内，而BMP-2的加入明显抑制了caspase-3的激活， FGF-4, EGF和PDGF则没有效果。将BMP-2的浓度增加到0.

应用胆管正常上皮细胞、肝内胆管癌及肝门部胆管癌细胞株,经qRT-PCR和Western blot检测各细胞株中FBXW7 mRNA和蛋白表达水平。2.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除胆管癌及对应癌旁新鲜组织,经Western blot检测胆管癌及癌旁组织中FBXW7蛋白表达水平。3.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。4.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。5.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除远端胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。[结果]1.

BMS-754807订单 qRT-PCR和Western blot结果显示正常胆管上皮细胞(HIBEpic)中FBXW7 mRNA和蛋白水平明显高于肝内胆管癌细胞(HuCCT1和RBE)及肝门部胆管癌细胞(QBC939和FRH0201)。2.收集7例胆管癌及对应癌旁新鲜组织,Western blot结果显示其中6例胆管癌癌旁组织中FBXW7表达明显高于胆管癌组织。3.通过免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝内胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝内胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期明显相关。4.通过免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝门部胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝门部胆管癌转移、分化程度及TNM分期明显相关。5.通过免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明各组间FBXW7表达无明显差异；统计学分析显示FBXW7表达与远端胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期无明显相关性。[结论]1.FBXW7在胆管正常上皮细胞中表达量明显高于肝内胆管癌细胞及肝门部胆管癌细胞,且FBXW7在胆管癌癌旁组织中表达明显高于胆管癌组织,提示FBXW7在胆管癌中为抑癌基因。2.

为什么 FBXW7可抑制肝内胆管癌及肝门部胆管转移,且与肿瘤分化程度及TNM分期明显相关。第二部分FBXW7调控胆管癌上皮-间质转化、干细胞特性及转移的作用研究[目的]上述临床研究结果表明FBXW7可抑制胆管癌转移,且与肝内胆管癌及肝门部胆管癌分化程度及TNM分期明显相关。本部分通过体外细胞实验和体内裸鼠转移模瘤型进一步检测FBXW7在胆管癌EMT、干细胞特性和转移中的作用。[方法]1.构建FBXW7干扰质粒(pBabe-shFBXW7.1及pBabe-shFBXW7.2),经逆转录病毒转染pBabe-shFBXW7.1、pBabe-shFBXW7.2及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较高的HuCCT1细胞和RBE细胞构建FBXW7稳定低表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western

blot检测所构建的稳定转染细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。2.构建FBXW7高表达质粒(pBabe-FBXW7),经逆转录病毒转染pBabe-FBXW7及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较低的QBC939细胞和FRH0201细胞构建FBXW7稳定过表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western NLG919 价格 blot检测所构建的稳定转染的细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。3.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,普通光学显微镜观察FBXW7表达改变对细胞表型的影响；经Western blot检测EMT相关标志分子(E-cadherin、 α-catenin、Fibronectin及Vimentin)的表达水平改变,验证FBXW7对胆管癌EMT的调控作用。4.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过Western blot检测其干细胞特性标志分子(Nanog、OCT4)的表达；经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验检测干细胞自我更新能力,验证FBXW7对胆管癌干细胞特性的调控作用。5.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室细胞迁移实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞迁移能力中的作用；经Matrigel侵袭实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞侵袭能力中的作用。6.

Although surgical resection combined with adjuvant therapy is effective at the early stages of the disease,resistance

to conventional therapies is frequently observed in advanced stages,where treatments become ineffective.Resistance to cisplatin,irinotecan and 5-fluorouracil chemotherapy has been shown to involve mitogen-activated protein Protein Tyrosine激酶抑制剂 kinase(MAPK)signaling and recent studies identified p38αMAPK as a mediator of resistance to various agents in CRC patients.Studies published in the last decade showed a dual role for the p38αpathway in mammals.Its role as a negative regulator of proliferation has 此网站 been reported in both normal(including cardiomyocytes,hepatocytes,fibroblasts,hematopoietic

and lung cells)and cancer cells(colon,prostate,breast,lung tumor cells).This function is mediated by the negative regulation of cell cycle progression and the transduction of some apoptotic stimuli.However,despite its anti-proliferative and tumor suppressor activity in some tissues,the p38αpathway may also acquire an oncogenic role involving cancer related-processes such as cell metabolism,invasion,inflammation and angiogenesis.In this review,we summarize current knowledge about the predominant role of the p38αMAPK pathway in CRC development and chemoresistance.In our view,this might help establish the therapeutic potential of the targeted manipulation of this pathway in clinical settings.
随着当今社会的发展,心血管疾病已成为影响人类生命的首位重大疾病。尽管最近内外科治疗有较大的进展,但因心血管病而住院的患者人数却逐年增加[1]。针对基因和蛋白的探索,为防治心血管疾病,提供新的治疗思路和潜在的药物靶点。1 14-3-3蛋白简介14-3-3蛋白家族,是一类高度保守的酸性蛋白,最早由Moore等于1967年为寻找在大脑组织中特异表达的蛋白而发现,并根据DEAE-cellulose chromatography和电泳分离
目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路与细胞空泡形成的关系。方法应用茴香霉素、放线菌酮、p38MAPK抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125处理HepG2、LM3、QBC939、Hela和A549细胞,光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞空泡化情况;Western

blot法检测p38MAPK等通路相关分子的表达水平;内质网红色荧光探针标记内质网,激光共聚焦显微镜观察内质网结构变化;溶酶体红色荧光探针标记溶酶体,激光共聚焦显微镜观察溶酶体荧光染色情况。结果 (1)茴香霉素对HepG2细胞空泡有消除作用。(2)茴香霉素通过活化p38MAPK消除细胞空泡。(3)阻断p38MAPK诱导多种肿瘤细胞空泡形成。(4)阻断p38MAPK介导的空泡形成破坏内质网结构的整体性。(5)阻断p38MAPK介导的空泡形成具有可逆性。结论 NVP-BEZ235 p38MAPK通路在调节细胞空泡形成中发挥了重要作用。
Objective To investigate the role of IQ domain GT Pase-activating protein 1(IQGAP1)in angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced podocyte apoptosis and the underlying mechanism.Methods Differentiated mouse podocytes were exposed to AngⅡat different concentrations for 6 h or at 10-8mol/L for variable incubation time.Podocyte apoptosis was assessed by flow cytometry.

A high frequency of hotspot mutations known as E542K,E545K and H1047R in the PIK3CA gene…
BACKG ROUD:ZSTK474[2-(2-difluoromethylbenzimidazol-1-yl)-4,6-dimorpholino-1,3,5-triazine]is a novel PI3K inhibitor which has potent anti-tumor effects.In addition,emerging evidence suggests ZSTK474may have anti-inflammatory and immunomodulatory properties

as well.Although its molecular mechanisms…
目的:利用荧光素酶报告基因系统,确定人p55PIK基因启动子全长序列和启动子核心序列;利用生物信息学技术,分析并预测人p55PIK基因启动子核心序列中可能影响转录活性的顺式作用元件;利用定点突变技术,观察上述DNA位点对p55PIK的转录活性的影响,明确哪些位点及相应转录因子在p55PIK的转录调节中起重要作用。 方法:以从正常人基因组DNA作为模板,用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法扩增基因组DNA人p55PIK基因5’端非编码区DNA不同长度片段,分别克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体得到(-651/+45)-p55PIK、(-839/+45)-p55PIK、(-1064/+45) PLX3397 花费 -p55PIK、(-1243/+45)-p55PIK和(-1633/+45)-p55PIK;在HepG2、Hela细胞中,利用荧光素酶报告基因法检测各片段DNA序列的报告基因活性,确定人p55PIK基因启动子活性最强的全长序列和活性变化最大的启动子核心序列;利用生物信息学方法,分析这一启动子核心序列并预测可能与之结合的转录因子和相应的顺式作用元件;利用定点突变技术结合荧光素酶报告基因检测技术,明确哪些位点及相应转录因子对p55PIK转录活性其重要作用。

此网站 结果:构建得到p55PIK基因上游调控区不同长度片段的荧光素酶报告基因载体(-651/+45)-p55PIK、(-839/+45)-p55PIK、(-1064/+45) -p55PIK、(-1243/+45)-p55PIK和(-1633/+45)-p55PIK,酶切及测序鉴定分子量及序列正确;观察各质粒的相对荧光素酶活性,HepG2中(-1243/+45)-p55PIK的相对荧光素酶活性分别为4.90±0.21, 购买BYL719 p0.05) 结论:人p55PIK基因的启动子全长片段位于(-1243/+45),其核心片段位于(-1243/-840);其中若干DNA位点可能与MZF1、YY1、RUNX1、ADR1、IRF1、Delta E、p300等转录因子结合并调节p55PIK基因的转录;位于p55PIK基因的启动子(-900/-896)的“TGGGGA”位点可能与MZF1蛋白结合显著影响p55PIK基因启动子的转录水平。 目的:阐明MZF1在p55PIK转录调控中的作用及其机制,并观察该作用对肿瘤细胞增殖的影响。 方法:我们利用染色质免疫共沉淀法验证了MZF1蛋白与p55PIK启动子(-900/-896)位点的TGGGGA序列DNA之间的结合,阐明MZF1对p55PIK的转录调控作用的具体机制。我们分别在肿瘤细胞系中高表达、低表达了MZF1蛋白。用荧光素酶报告基因系统、荧光定量PCR法和Western

Blot免疫印迹法分别检测了p55PIK基因的转录水平、mRNA水平和蛋白表达水平的变化,阐明p55PIK是否受MZF1的转录调控;利用BrdU掺入法检测了细胞DNA合成能力,利用Ki67法检测了细胞增殖相关抗原的表达,p55PIK接受MZF1蛋白的转录调控对肿瘤细胞增殖的影响。在该作用的临床意义方面,我们利用荧光定量PCR法,检测了10例结直肠癌患者的肿瘤标本和正常组织标本中的MZF1和p55PIK的mRNA水平,分析了二者的表达的变化及相关性,阐明p55PIK表达与MZF1的表达的相关性,以及p55PIK在结直肠肿瘤发生发展中的作用及意义。 结果: MZF1 Antibody组和Input组均有明显的条带,而阴性对照IgG组则无明显条带。GFP-MZF1质粒组的p55PIK全长相对荧光素酶活性显著高于GFP空质粒组(P<0.01),MZF1-SiRNA组的p55PIK全长相对荧光素酶活性较SiRNA组显著降低(P<0.01),MZF1-SiRNA组的p55PIK的mRNA水平显著低于(SW480中P<0.01,LOVO中P<0.05)。GFP-MZF1质粒组DNA合成能力显著高于GFP空质粒组(P<0.01),MZF1-SiRNA组组DNA合成能力显著低于SiRNA组(SW480中P<0.01,LOVO中P<0.01),MZF1-SiRNA组Ki67荧光强度显著低于SiRNA组(P<0.

07倍,提示SKBR3/TDR对MK-2206无耐药性。不同浓度的MK-2206与trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明显,差异具有统计学意义(P0.05)(图7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR细胞内的蓄积。3. Western Blot检测结果显示MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。与对照组相比,不同浓度的MK-2206处理SKBR3/TDR和SKBR3细胞后,均可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达,且呈剂量依赖性(图8、图9),实验组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明了联合应用trastuzumab和MK-2206的有效性。结论通过建立裸鼠HER2阳性乳腺癌模型及相关动物实验,结果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。MK-2206与trastuzumab联合应用可以下调p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌trastuzumab耐药。P-PRAS40-Thr246是一个新型的乳腺癌治疗靶点,为逆转trastuzumab耐药的研究提供帮助。
目的：肝细胞肝癌(Hepatocellular

ATM激酶抑制剂体内 carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一,在男性癌症死亡率中居于第二位。肝脏切除、肝移植、局部消融等治疗方式使肝癌的治愈成为可能,但多数肝癌患者有肝硬化背景,在发现时已经处于病程的中晚期,仅有30%～40%的患者适合该治疗,且其术后5年的复发率高达70%。介入化疗栓塞等只能暂时缓解肝癌患者的临床症状,并不能有效显著改善患者的预后。索拉菲尼(sorafenib),一种多蛋白激酶抑制剂,具有抗血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重作用,是治疗进展期肝癌的一线用药。但是由于肝癌复杂的生物学特性,通过其内在的或获得的机制造成对索拉菲尼的耐药,导致索拉菲尼治疗进展期肝癌效果极其有限。但索拉菲尼治疗失败后尚无有效的化疗药物可以应用,因此探讨索拉菲尼耐药的机制对于改善进展期肝癌患者的预后显得迫切和重要。在中国,大约75%的肝癌患者患有乙型病毒性肝炎,持续的慢性肝脏损伤刺激星形细胞和成纤维细胞,形成肝脏的纤维化,纤维化最终发展为肝硬化。肝硬化破坏了肝脏正常的血液供应,导致肝脏血流循环减少,形成局部缺氧的微环境；从肝脏一般性腺瘤样增生、不典型腺瘤样增生到早期癌的演变中,细胞的快速增殖也会造成肿瘤局部缺氧。索拉菲尼在抑制肿瘤新生血管生成的同时,又加重了肿瘤内部的缺氧。而肿瘤内部的缺氧微环境(hypoxic

microenvironment)加剧了肿瘤细胞基因的不稳定性并诱导肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)相关蛋白的表达,造成肿瘤对化疗和放疗的耐受。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)是肿瘤缺氧反应中的关键因子,其通过调控肿瘤能量代谢、新生血管形成、增殖、浸润和转移等相关基因的转录和表达,决定着肿瘤的发生发展。因此下调缺氧诱导因子、促进它的降解或抑制它的功能等,都可以阻断缺氧诱导反应,达到抑制肿瘤的效果。HIF是由α亚单位和p亚单位组成的异构二聚体,属于碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子家族成员。HIF主要包括HIF-1α和HIF-2a,尽管二者有48%的同源氨基酸序列,结构相似,但其不同之处正在不断被发现。HIF-la在急性缺氧环境下被激活并稳定表达,但随着缺氧时间的延长其蛋白表达水平逐渐降低直至消失,相反HIF-2a的含量随着缺氧时间的延长持续增加。缺氧诱导的基因如VEGF在急性缺氧期是HIF-1a的靶基因,而随着缺氧时间的延长主要由HIF-2a激活。与HIF-1a广泛分布不同,HIF-2a仅能在特定细胞如肝细胞内表达。肝细胞内的血管生成素基因主要由HIF-2a调控,而灭活HIF-2a可以抑制VHL相关肝血管瘤的生长。同HIF-1a相比,HIF-2a可能在肝癌发生发展中发挥更加重要作用,是治疗肝癌的一个潜在靶点。就HIF-2a在肝癌发生发展中的作用人们做了初步的探讨,多数研究认为HIF-2a促进肝癌的发生发展,然而也有少数研究提示HIF-2a对肝癌的进展具有负调节作用,表明HIF-2a在肝癌发生发展中的作用存在争议,这从另一方面也反映了HIF-2a在肝癌发生发展中的作用机制是复杂的。研究表明,肿瘤特异性的缺氧微环境可能与索拉菲尼的耐药相关,但其确切的机制尚未完全阐明。因此,我们设计实验研究HIF-2a在肝癌发生发展中的作用,探索缺氧微环境下索拉菲尼的耐药机制,这样不仅可以进一步完善肝癌发生发展分子机制理论,而且有望为提高索拉菲尼治疗肝癌的疗效提供潜在的靶点。方法：1.应用免疫组织化学及免疫印迹方法检测肝癌肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721中HIF-2a蛋白的表达,分析HIF-2a蛋白表达水平与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系。2.既往的研究表明：缺氧培养的肝癌细胞系同常氧培养相比其索拉菲尼IC50显著增高,提示缺氧增加了肝癌细胞系对索拉菲尼的抵抗。为进一步研究是HIF-1a还是HIF-2a影响了缺氧微环境下肝癌对索拉菲尼的治疗效果,本课题应用Western

Onalespib GDC-0449供应商 blot观察索拉菲尼治疗前后肝癌细胞系中HIF-1α、HIF-2a的表达。体外实验和裸鼠成瘤实验观察HIF-2a封闭前后索拉菲尼对肿瘤细胞增殖能力的影响,探讨HIF-2a在索拉菲尼耐药中的作用。3.采用细胞免疫化学和TOP-Flash荧光素酶报告实验观察HIF对Wnt/β-catenin经典信号通路活性的影响。4.采用基因干扰技术检测HIF-2α封闭前后及c-Myc封闭前后Wnt/β-catenin通路中关键蛋白的表达,分析缺氧环境中HIF-2α表达与Wnt/β-catenin信号通路间的关系。Western blot分析肝癌移植瘤模型中对照组、索拉菲尼治疗组、HIF-2α shRNA组及联合组中HIF-2α、Wnt/β-catenin通路中关键基因的表达,深入探讨缺氧微环境中索拉菲尼耐药的分子机制。结果:1. Western blot分析发现,肝癌组织中HIF-2α的蛋白表达水平明显高于癌旁组织中HIF-2a的蛋白表达水平(P<0.05)。与HIF-1α不同,HepG2细胞经索拉菲尼处理后其HIF-2α蛋白的表达量较未处理组增加1.7倍,经统计学检验,具有统计学意义(P<0.

体外培养HTCFs及鉴定：于青光眼滤过术中取患者的Tenon’s囊组织,采用组织块培养法进行HTCFs的原代培养。并对HTCFs进行传代培养。免疫细胞化学染色法对细胞进行波形蛋白抗体及角蛋白抗体的染色，鉴定所培养的细胞是否为成纤维细胞。 2.MTT法检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFs增殖的影响：分别在细胞接种后的第24h、第48h以及第72h进行MTT比色试验，检测不同浓度的GBE（25、50、100、200mg/L）对TGF-β1(2ng/L)诱导的HTCFs增殖的影响。

3.流式细胞仪检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFs细胞周期的影响:实验分为3组（n=3），分别为对照组、TGF-β1（2ng/ml）组， GBE（200mg/L）+TGF-β1（2ng/L）组,于接种后72h收集细胞，流式细胞仪检测各组细胞周期，细胞周期分析软件MultiCycle分析DNA数据，计算HTCFs增殖指数（proliferadtion index，PI）,PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。 4.免疫细胞化学染色法检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFsα-SMA表达的影响：实验分组同上,于细胞接种后72h收集细胞，免疫细胞化学SABC法检测各组α-平滑肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）的表达情况。 5.RT-PCR检测GBE对TGF-β1诱导的HTCFsCTGFmRNA表达的影响：实验分组同上,于细胞接种后72小时收集细胞，RT-PCR检测各组CTGFmRNA的表达。 结果：1.HTCFs易于体外培养，细胞增殖活跃，传代后性状稳定，免疫细胞化学波形蛋白抗体染色阳性，角蛋白染色阴性，证实所培养的细胞为成纤维细胞。 2.TGF-β1能有效促进HTCFs的增殖，随着GBE（25、50、100、200mg/L）浓度的增加及作用时间的延长，HTCFs的增殖活性逐渐增强（p
研究目的

还有 雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)是一种用于治疗骨质疏松的新型药物,它具有使大鼠骨髓间充质干细胞(rat http://www.selleck.cn/products/azd6738.html bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)向成骨细胞方向转化的作用,除此之外,它还有改善骨强度,促进新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)和P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路调节成骨细胞特异性转录因子Runx2(Cbfal)的转录活性,Runx2则调节下游成骨基因,如骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅱ型胶原(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的表达,促进BMSCs的成骨分化。 转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一,它有着极其广泛的生物学功能,不仅调控rBMSCs的生长发育和分化,而且能促进rBMSCs向成骨细胞的发育和转化,调控成骨细胞的生长发育和增殖,在合成骨基质和形成骨重建方面也起着重要的作用,是调控rBMSCs生长发育和向成骨细胞分化的首选的生长因子之一；它还可参与调控多种细胞的生长发育和生物学功能。相关资料表明,TGF-β1可能在锶促进rBMSCs向成骨细胞分化的过程中起着重要的作用。但是,TGF-β1在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中的作用如何迄今未见报道。本文旨在重点探讨：①Sr对rBMSCs的TGF-β1表达的影响；②TGF-β1是否在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中起作用,以便为Sr的促成骨作用机制提供新颖的实验资料。 研究方法

1.建立rBMSCs体外分离、培养的方法体系。 取四周龄,雌雄不限SD大鼠,取出大鼠双侧的股骨,胫骨,用全骨髓贴壁的方法分离出rBMSCs,用含培养液的10m1注射器从大鼠骨髓中将rBMSCs从骨髓中冲洗出来,直至骨髓腔发白,将收集好的细胞悬液离心,去上清,置于25cm2培养瓶中,并于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱培养,当细胞铺满瓶底80%左右时进行传代培养和适当的冻存。并取第3-5代的细胞用于实验。用倒置显微镜观察细胞生长发育状态,并鉴定所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 2.定向诱导rBMSCs向成骨细胞分化 取生长状态良好的第3-5代rBMSCs,调整其浓度为105/ml左右,取细胞悬液4ml接种,并用成骨诱导液(含10-8的地塞米松,0.2mM的维生素C,10mMβ-甘油磷酸钠)培养,当细胞融合达到60%-70%时,进行实验操作。 3.实验分组 (1)碱性磷酸酶(ALP)指标测定的实验分组 ①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs,分别为对照组、Sr=0.1、Sr=l、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM,每组设5复孔,六组均在成骨诱导液条件下诱导rBMSCs7天。当Sr=3mM时,ALP活性最大。 那个 ②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液培养；Sr+SB组：Sr+SB431542+成骨诱导液：先用10gmol/L SB431542(TGF-β1抑制剂)预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO组：DMSO+成骨诱导液,用10μmol/LDMSO培养；共培养rBMSCs7天,测定ALP活性。 (2)茜素红钙结节染色的实验分组 ①分为两组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组：用成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液,共培养21天。 ②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液；Sr+SB431542组：Sr+SB431542+成骨诱导液,先用10gmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO+成骨诱导液组：用10μmol/LDMSO培养：共培养rBMSCs21天,测定钙结节数目。 (3)TGF-β1蛋白表达的实验分组 ①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs.分为对照组、Sr=0.

31±16.25和401.48±35.59),且8001μM组引起的释放量大于400μM组。

4、IL-p的检测结果显示,P物质200μM组在4个时间点与空白对照组相比,均无统计学差异。P物质400μM组和800μM组从6h开始,IL-p释放量明显增加(212.64±15.01和414.69±20.74),12h达到高峰(分别为285.04±20.74和642.6±11.62),24h浓度有所降低(分别为223.97±4.73和367.33±13.42),与TNF-a的释放量类似,800μM组引起的释放量大于400μM组。 5、胞内钙离子成像测定结果显示,P物质200μM或400μM孵育后均未能改变胞浆内Ca2+浓度。当P物质浓度达到800μM时,胞浆内Ca2+迅速降低,镜下观察发现部分细胞失去贴壁能力。 6、P物质400μM孵育脊髓小胶质细胞15min后,胞内p38MAPK磷酸化水平明显升高。 7、P物质400μM孵育12h预先活化的小胶质细胞注入成年SD大鼠脊髓蛛网膜下腔后,动物PWL减小,出现热痛觉敏感,并可持续至注射后24h。结论： MK 1775 1、P物质可以诱导脊髓小胶质细胞活化,其有效浓度为400μM,至少需持续作用6h。 2、P物质可以诱导小胶质细胞p38MAPK的磷酸化,但未能升高小胶质细胞胞内钙离子浓度。

3、P物质活化的脊髓小胶质细胞参与热痛觉敏感的形成。 4、 P物质诱导脊髓小胶质细胞活化参与热痛觉敏感的形成可能与p38MAPK信号通路活化,并使细胞释放促炎因子TNF-α、IL-1β有关。
目的：应用5’-磷酸腺苷(5′-AMP)诱导低温作用于LPS诱导的大鼠炎症动物模型,分析ERK1/2、JNK、p38和NF-κB四条信号通路,明确5’-磷酸腺苷(5′-AMP)诱导低温抗炎的可能机制。 方法：将成年健康的Wistar随机分为四组：空白对照组、LPS阳性对照组、5′-AMP低温预防治疗组、5′-AMP低温治疗组。每组12只大鼠。每组大鼠在注射LPS6h和12h后眼静脉丛取血保存,在LPS注射12h后取肺组织,分别冻存和福尔马林固定。ELISA法测定血清中CD14、CRP和MCP-1的表达水平,免疫组化法观察TLR4在肺组织中的表达情况,Western Selleckchem PLX4032 Blot技术测定ERKl/2、JNK、p38和NF-κB四条信号通路总蛋白和磷酸化蛋白的水平。 将36只Wistar大鼠随机分为三组：LPS炎症组、5′-AMP低温预防治疗组、5′-AMP低温治疗组,每组12只大鼠,进行生存分析,记录每组12h内大鼠的生存率,重复三次。 结果：实验结果表明,与LPS组相比,无论是5′-AMP低温预防组还是5′-AMP低温治疗组,都能显著地降低血清中CD14和CRP的表达水平。免疫组化结果显示,肺组织中TLR4的表达量LPS组显著高于5′-AMP低温干预组。Western

Blot结果显示,5′-AMP诱导的低温能够抑制炎症信号通路ERK1/2、JNK、p38和NF-κB的激活。另外,5′-AMP低温治疗组和5′-AMP低温预防组大鼠的生存率和生存时间显著高于LPS炎症组,且5′-AMP低温预防组的效果优于5′-AMP低温治疗组。 结论：5′-AMP诱导的低温能够通过降低炎症因子表达水平及抑制炎症信号通路ERKl/2, p38, JNK和NF-κB的激活而发挥抗炎作用,保护炎症模型动物组织器官免受损伤。
目的通过观察不同时间段肺组织中小窝蛋白-1(caveolin-1, Autophagy Compound Library购买 cav-1)、p-P38MAPK和IL-8的表达水平,探讨cav-1在机械通气所致肺损伤(VILI)发生中的作用。方法雄性Wistar大鼠24只,随机分为3组：对照组、大潮气量通气半小时组(H-VT0.5h组)和大潮气量通气2小时组(H-VT2h组)。在光镜下观察各组大鼠肺组织病理学改变,测定BALF总蛋白含量和肺湿/干重比值(W/D),采用免疫组织化学染色法测定肺组织cav-1、p-P38MAPK和IL-8的蛋白表达水平,并进行相关性分析。 结果 1.肺组织cav-1表达结果：H-VT0.5h组(0.142±0.014)和H-VT2h组(0.267+0.017)cav-1蛋白表达均明显高于对照组(0.118±0.010)(均P<0.01),H-VT2h组cav-1蛋白表达明显高于H-VT0.5h组(P0.05)。 3.肺组织P-P38MAPK表达结果：H-VT2h组(0.514±0.031)p-P38MAPK蛋白表达明显高于对照组(0.148±0.016)和H-VT0.5h组(0.166+0.010)(均P0.05)。 4.肺组织cav-1、p-P38MAPK、IL-8相关性分析结果：各组大鼠肺组织中cav-1蛋白表达与p-P38MAPK之间呈正相关(r=0.787,P0.05)。 6.BALF总蛋白含量测定结果：H-VT2h组(0.620±0.140)BALF中总蛋白含量明显高于对照组(0.220±0.063)和H-VT0.5h组(0.300±0.140)(均P0.05)。 7.肺组织病理学结果：随着机械通气时间延长,大鼠肺组织损伤程度呈逐渐加重趋势。结论 1.大潮气量机械通气诱导了cav-1的表达,早期(0.5h内)以保护作用为主,后期(2h后)以损伤作用为主。 2.

抑制ILK显著加重心脏缺血再灌注室性心律失常发生;2.ILK激动剂可明显减轻再灌注室性心律失常的严重程度,而且该效果可被ILK抑制剂所消除。第二部分:Cx43在ILK保护缺血再灌注室性心律失常中的作用1.ILK活性调节剂预处理后各组心肌组织总的Cx43的蛋白表达水平无明显改变。2.ILK激动剂可稳定心脏缺血再灌注后Cx43在闰盘处的分布,相反,ILK抑制剂可促进心脏缺血再灌注后Cx43的侧面化,并阻断ILK激动剂抑制Cx43重新分布的作用。第三部分:Akt在ILK调控Cx43重塑中的作用Akt抑制剂预处理后再予ILK激动剂处理发现,Akt抑制剂可拮抗ILK激动剂的抗缺血再灌注室性心律失常的作用,同时阻断ILK激动剂稳定Cx43闰盘分布的作用。结论:1.ILK具有改善大鼠缺血再灌注室性心律失常的作用;2.ILK发挥抗心律失常的机制与抑制Cx43重新分布有关;3.ILK抑制Cx43重新分布通过激活Akt473位点的磷酸化来实现。
高脂血症引起的以肥胖、胰岛素抵抗、高血压等为表现的代谢综合征的发病率逐年升高,并呈年轻化趋势,其可导致大血管病变发病风险的增加。在高血脂作用下,内皮功能发生紊乱,其主要机制是血管内皮合成释放的各种血管活性物质和细胞因子二者之间的平衡被打破。内皮功能紊乱被认为是促进大血管病变早期发生发展的主要因素。因此,改善内皮功能紊乱并阻止其进展将会有效降低代谢综合征的发病率。k-阿片受体(k-opioid Afatinib供应商 receptor,k-OR)在心血管系统中广泛表达。心脏可产生并释放内源性k-阿片肽,其可作用于k-OR从而调节心血管系统的活动。我们课题组既往的研究发现:①激活k-OR能够以时间、剂量以及内皮依赖性的方式舒张大鼠的腹主动脉,在整体可以显著降低正常和高血压大鼠的动脉血压;②激活k-OR可上调低氧条件下NO的水平,同时抑制内皮素(ET-1)和血管紧张素II(Ang

II)的表达,并可改善低氧诱导的肺动脉内皮功能紊乱;③激活k-OR还可以抑制心肌缺血导致的炎症反应和心肌细胞凋亡。这些作用均与NO的生成密切相关,提示k-OR的激活可能具有内皮依赖性的舒张血管、调节血管舒张/收缩因子的平衡状态、改善内皮功能以及抗炎等作用。然而,关于k-OR在高脂引起的内皮损伤中的调节作用及分子机制尚不明确,因此,本课题在前期工作的基础上,成功构建了高脂诱导的内皮细胞凋亡模型,观察k-OR在改善高脂诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用及其可能的分子机制。研究结果可为治疗高脂血症引起的内皮损伤提供新的策略。【目的】1.在高脂诱导的内皮凋亡模型中,阐明k-OR的激活对内皮细胞生物学行为的影响;2.揭示k-OR的激活对内皮细胞生物学行为产生影响的具体分子机制。【材料与方法】1.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经培养和鉴定后,用软脂酸钠(sodium

也许 palmitate)高脂诱导细胞损伤48小时后进行后续实验。2.分组情况如下:正常对照组;高脂处理组;高脂处理+U50,488H(选择性k-OR激动剂)组;高脂处理+U50,488H+nor-BNI(选择性k-OR拮抗剂)组。3.采用光学显微镜观察各组细胞生长状态。4.采用油红染色分析各组细胞脂滴合成情况。5.采用细胞活力测定试剂盒(CCK-8)评价各组细胞生长活力。6.采用双染色法,通过流式细胞技术分析各组细胞凋亡比率。7.采用特异性抑制剂和小干扰RNA分别处理细胞,通过Western blot法检测各组细胞中k-OR、p-Akt、total-Akt、p-e NOS、total-e NOS、Caspase 3等分子的蛋白表达情况。8.利用一氧化氮检测试剂盒,检测各组细胞培养上清中NO的含量。【结果】1.k-OR的激活对高脂诱导的HUVEC生物学行为的影响Sodium 很少 palmitate处理48小时后,高脂处理组细胞数目减少,细胞形态发生变化,呈典型的凋亡形态,细胞中脂滴含量增加;同时,细胞生存率明显下降,凋亡显著上调。U50,488H可以显著改善高脂诱导细胞的生长状态,降低细胞中脂滴的含量,提高细胞生存率,抑制细胞凋亡。上述作用可被κ-OR拮抗剂nor-BNI所阻断,表明U50,488H是通过激活κ-OR,并可能介导了下游信号通路的活化,继而引发了一系列细胞生物学行为的改善。2.κ-OR的激活在改善高脂诱导的内皮细胞凋亡中的可能机制实验表明U50,488H可通过激活k-OR并活化PI3K-Akt-e

NOS信号通路,进而促进NO的生成,同时抑制Caspase 3的表达,从而抑制高脂诱导的细胞凋亡。为进一步验证抗高脂诱导的细胞凋亡的作用是由κ-OR介导的,并且是通过PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化实现的,本实验利用针对κ-OR和Akt的si RNA处理细胞,结果表明转染针对κ-OR的si RNA后高脂诱导的细胞凋亡显著增加,转染针对Akt的si RNA后可以阻断U50,488H的抗凋亡作用。上述结果表明,κ-OR介导的抗高脂诱导的细胞凋亡的作用与PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化有关。【结论】本研究首次提出κ-OR激动后能够通过介导PI3K-Akt-e NOS信号通路的活化,提高e NOS的生物活性,促进NO的生成,从而抑制高脂诱导的细胞凋亡。研究结果为临床应用阿片类物质防治高脂诱导的内皮损伤提供了理论依据,同时为防治高脂血症与代谢综合征向心血管疾病的发展提供了新的思路及策略。
背景乳腺癌是威胁妇女身心健康的常见恶性肿瘤,目前发病率排在女性恶性肿瘤的第一位,死亡率排在第六位。化疗是乳腺癌综合治疗的重要步骤之一,但化疗可以使乳腺癌细胞产生多药耐药,从而导致化疗失败。研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, P13K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)(AKT)信号传导通路的激活参与了乳腺癌的多药耐药过程。因此,PI3K-AKT信号通路被认为是重要的乳腺癌治疗靶点,一些PI3K-AKT信号传导通路的小分子抑制剂已经进入临床研究阶段,在乳腺癌的靶向治疗方面显示出了良好的应用前景。MK-2206是人工合成的高选择性非ATP竞争的特异性的新型小分子AKT抑制剂,在多种肿瘤中都显示出了较好的肿瘤抑制效果,目前已进入到Ⅱ期临床研究阶段。目的本实验以乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞为研究对象,在细胞水平初步探讨MK-2206对其杀伤及逆转作用,验证拮抗p-(Thr246)PRAS40的表达能否部分逆转乳腺癌细胞的阿霉素耐药,为乳腺癌的临床用药提供依据。方法1.细胞培养：培养人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞,阿霉素维持浓度为1ug/mL.实验前两周,对MCF-7/ADR进行无药培养。取对数生长期细胞进行实验。2.CCK-8检测：利用CCK-8法检测阿霉素和MK-2206对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性、耐药倍数以及MK-2206逆转MCF-7/ADR耐药的作用。3.流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测无毒剂量的MK-2206联合阿霉素作用于MCF-7/ADR细胞后,其凋亡率的变化以及MCF-7/ADR细胞内阿霉素含量的变化。4.